上，室溫下持續(xù)攬拌1小時(shí)至 反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，使用帶冷阱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀持續(xù)蒸發(fā)30至120分鐘除去粗產(chǎn)品中的 TFA。然后用二甲基甲酯氨值M巧多次清洗多膚抗原的粗品，最后將混合在一起的樹(shù)脂用砂 屯、漏斗過(guò)濾出來(lái)，既得到包被抗原。
[0072] 2、包被抗原的鑒定
[0073] 多膚抗原合成完畢后用基質(zhì)輔助激光解吸飛試時(shí)間質(zhì)譜法（M0DAL-TCF)和反相 高壓液相色譜法（RP-HHX)進(jìn)行定性定量分析，用常見(jiàn)的氨基酸分析來(lái)鑒定所合成的膚。
[0074] 3、包被抗原純化
[00巧]將環(huán)化后的多膚抗原使用循環(huán)式切向過(guò)濾膜包進(jìn)行超濾（用PA化公司生產(chǎn)的TangentialFlowDevice循環(huán)式切向過(guò)濾膜包W及與其配套的蠕動(dòng)累），多膚抗原作為大 分子不能通過(guò)一定孔徑的濾膜，而前期合成過(guò)程W及后期環(huán)化反應(yīng)形成或引進(jìn)的小分子雜 質(zhì)則可W通過(guò)濾膜。然后再通過(guò)孔徑為0. 2ym過(guò)濾器除菌，將最后所得溶液分裝到無(wú)菌塑 料瓶?jī)?nèi)，貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多膚的名稱、編號(hào)、生產(chǎn)批號(hào)、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保 存條件，分裝后，儲(chǔ)存于-20°C或-40°C備用。
[0076] 4、包被抗原冷凍干燥
[0077] 為了便于長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸，需要將包被抗原進(jìn)行冷凍干燥W得到固體狀態(tài)的多 膚。將預(yù)先冷凍好的包被抗原放置于Labconco的冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行干燥，得到固體狀態(tài)的 包被抗原。包裝后貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多膚的名稱、編號(hào)、生產(chǎn)批號(hào)、濃度、生產(chǎn)日期、保 存期限及保存條件。
[0078] 實(shí)施例2、口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備
[0079] 口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒包括：
[0080] (1)包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯己締酶聯(lián)反應(yīng)板；2X96孔。
[0081] (2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG多克隆抗體（購(gòu)自sigma公司，貨號(hào) A5670)，2 瓶（各 12ml)。
[0082] (3)陽(yáng)性對(duì)照血清：是W實(shí)施例1中人工化學(xué)合成的包被抗原作為免疫原，免疫 25-35日齡無(wú)特定病源體（SP巧豬制備的高免血清，加入lOOOU/ml鏈霉素和lOOOU/ml青霉 素，過(guò)0.2ym濾膜除菌，作為試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照血清。1管（1ml)。
[0083] (4)陰性對(duì)照血清：是用無(wú)口蹄疫抗體的正常豬血清，加入lOOOU/ml鏈霉素和 lOOOU/ml青霉素，過(guò)0. 2ym濾膜除菌，作為試劑盒陰性對(duì)照血清。1管（1. 5ml)。
[0084] (5)底物顯色液：由兩種溶液混合組成，溶液I為0. 02mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)溶液（1瓶（12ml));溶液II為含0. 05%過(guò)氧化氨尿素的巧樣酸磯酸鹽緩沖液（1瓶 (12ml))，使用時(shí)兩者W體積比為1 : 1的比例混合。
[0085] (6)濃縮洗漆液（20X) ;0. 01M，pH7. 4,含有 0. 8%~1. 2% (ml/ml)Tween-20 和 0.05% (g/ml)疊氮鋼防腐劑的磯酸鹽緩沖液，抑為7. 4,后經(jīng)過(guò)0.2ym濾膜除菌。50ml/ 瓶，2瓶。
[0086] (7)終止液；2mol/L的硫酸溶液。1瓶（12ml)
[0087] 做樣品稀釋液冶有3% (g/mUBSA的0. 15M、抑為7. 4的PBS緩沖液，過(guò)0. 45ym 濾膜。2瓶（各12ml)。
[0088] 根據(jù)需要，試劑盒中還可W有血清稀釋板1塊（96孔），用于血清樣品的梯度稀釋。
[0089] 其中，包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯己締酶聯(lián)反應(yīng)板的制備方法為：將 實(shí)施例1制備的多膚抗原溶于抑9. 4的碳酸鹽溶液，然后加到96孔聚苯己締酶聯(lián)反應(yīng)板， 每孔50ng抗原（其中序列表中序列1所示的多膚為25ng，序列表中序列2所示的多膚為 25ng。），在37°C放置2-4小時(shí)，再4-8°C下放置過(guò)夜使多膚抗原與酶聯(lián)反應(yīng)板充分結(jié)合。然 后按照300y1/孔加入含1% (g/ml)牛血清白蛋白炬SA)的PBS緩沖液（pH= 7. 4)，37°C 封閉1-2小時(shí)，用洗漆緩沖液（濃縮洗漆液用蒸饋水或去離子水20倍稀釋得到洗漆緩沖 液）洗漆后甩干，待酶聯(lián)反應(yīng)板干燥后4°C密封保存。
[0090] 實(shí)施例3、口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的符合率試驗(yàn)
[0091] 一、口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用方法
[0092] 1、平衡；將保存在4°C的試劑盒取出，平衡至室溫備用；液體試劑用前混勻。
[0093] 2、配液；將濃縮洗漆液用蒸饋水或去離子水20倍稀釋得到洗漆緩沖液；
[0094] 3、設(shè)定；留1個(gè)空白孔，3個(gè)陰性對(duì)照孔，和2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，其余為待測(cè)樣本孔。
[0095] 4、待測(cè)標(biāo)本預(yù)稀釋；使用樣品稀釋液將待檢樣品血清、陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血 清按照1 : 21的比例稀釋；往稀釋板孔內(nèi)每孔加lOOyl樣本稀釋液，分別加入5yl待測(cè) 樣本。
[0096] 5、加樣誼白孔不加樣；3個(gè)陰性對(duì)照孔各加100y1陰性對(duì)照，2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔各 加 100y1陽(yáng)性對(duì)照；其余孔分別按預(yù)先設(shè)定加100y1稀釋的待測(cè)樣本。加樣過(guò)程時(shí)間跨 度應(yīng)盡量短。
[0097] 6、溫育；震蕩混勻，置37°C溫箱或水浴鍋中，反應(yīng)30分鐘。
[0098] 7、洗板；棄去反應(yīng)液，每孔加300y1步驟2中得到的洗漆緩沖液，浸泡15秒，甩棄 洗液。連續(xù)洗板4次后拍干。
[0099] 8、加酶；空白孔不加酶；其余各孔加100y1辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG
[0100] 多克隆抗體。
[0101] 9、溫育；置37°C溫箱或水浴鍋中，反應(yīng)30分鐘。
[0102] 10、洗板；棄去反應(yīng)液，每孔加入稀釋后的洗漆緩沖液300 ^1，浸泡15秒，甩棄洗 漆液。連續(xù)洗板5次后拍干。
[0103] 11、顯色；每孔分別加入100 的底物顯色液（其中溶液I和溶液IIW體積比為 1 : 1的比例混合）。加蓋，37°C恒溫箱里反應(yīng)15分鐘；
[0104] 12、每孔分別加入100y1終止液終止反應(yīng)，混勻；
[0105]13、測(cè)定每孔的0〇45。值（加終止液的反應(yīng)板應(yīng)在15分鐘內(nèi)讀取0D45。值）。
[0106] 檢測(cè)結(jié)果的判定：
[0107] 1、陰性對(duì)照〇〇4日。平均值應(yīng)該《0. 2,否則無(wú)效。
[010引 2、陽(yáng)性對(duì)照每個(gè)檢測(cè)值應(yīng)該在0. 6-1. 8之間，否則無(wú)效。
[0109] 3、臨界值的計(jì)算；臨界值=0. 23X陽(yáng)性對(duì)照0〇45。值平均值。
[0110] 樣品〇〇45。值< 臨界值，則初步檢測(cè)為FMDV陰性；樣品0D值貧臨界值，則初步檢測(cè) 為FMDV陽(yáng)性，需重新檢測(cè)。重檢時(shí)每重檢樣品平行2次。重檢后若兩孔均為FMDV陰性，貝U 判斷為FMDV陰性諾任一孔為陽(yáng)性，則判斷為FMDV陽(yáng)性。
[0111] 二、乳鼠血清中和試驗(yàn)（MSN)方法
[0112]目前國(guó)內(nèi)常用的口蹄疫血清學(xué)檢測(cè)方法之一是乳鼠中和試驗(yàn)（MSN)，因此用本試 劑盒同乳鼠中和試驗(yàn)進(jìn)行符合率試驗(yàn)。
[0113] 材料
[0114] 1.免疫血清50頭份抗體陽(yáng)性血清（包括豬口蹄滅活疫苗免疫后的陽(yáng)性血清25 份、口蹄疫0型病毒合成膚疫苗免疫后得到的陽(yáng)性血清19份及田間采集的陽(yáng)性血清6份） 由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供。
[0115] 2.健康豬血清由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供。
[0116] 3.試驗(yàn)用病毒為口蹄疫0R/80病毒，毒種由蘭州獸醫(yī)研究所提供，由中牧實(shí)業(yè)股 份有限公司蘭州生物藥廠保存和使用，將病毒經(jīng)6-8日齡乳鼠傳2代后，收集病毒。用3-4 日齡乳鼠測(cè)定并調(diào)整其毒價(jià)至lOOOLDw/0. 2ml，置于-20°C保存待用。
[0117] 乳鼠血清中和試驗(yàn)方法如下：
[0118] 將每頭份待測(cè)血清分別與lOOXLDw/0. 1ml的0MII系病毒液等量混合，于37°C 解育1小時(shí)，然后接種3日齡乳鼠（頸部皮下注射0. 2ml)，每組（亦即每個(gè)待測(cè)血清）4只， 同時(shí)設(shè)立病毒對(duì)照、健康對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照組，每組3只，觀察7山記錄乳鼠死亡比