一種glp-1衍生物的制作方法
【專利說(shuō)明】-種GLP-1衍生物
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明設(shè)及膜高血糖素樣膚-1 (GLP-1) (7-37)衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，W及 設(shè)及其一些治療用途。
[000引【背景技術(shù)】； 膜高血糖素樣膚-1 (GLP-1)是腸促膜島素的一族，由腸道L細(xì)胞分泌，是一種在餐后 分泌的激素、有助于控制血糖，可W作為2型糖尿病治療的一個(gè)重要祀點(diǎn)。但是GLP-1在體 內(nèi)迅速被一種酶值PP-4)所降解，在體內(nèi)的血漿半衰期（tl-2分鐘。該種代謝不穩(wěn)定性限 制了天然GLP-1的治療效能。因此，需要一種較天然GLP-1更有效或代謝上更穩(wěn)定的GLP-1 衍生物。
[0003]DPP-4酶抑制劑，對(duì)DPP-4有抑制作用，能提高和延長(zhǎng)GLP-1的激素活性，從而刺激 膜島素的釋放，減少膜高血糖素的分泌。該兩種作用都有利于2型糖尿病患者血糖高水平 的調(diào)節(jié)。
[0004] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)GLP-1 (7-37)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，并在側(cè)鏈上引入DPP-4酶抑制劑， 能夠得到比天然GLP-1代謝上更穩(wěn)定的GLP-1衍生物。
[0005] 化合物特征： 一種GLP-1 (7-37)或與GLP-1 (7-37)相比有最多達(dá)8個(gè)氨基酸改變的GLP-1 (7-37) 類似物的衍生物，所述GLP-1 (7-37)類似物具有人GLP-1的功能，其特征在于所述衍生物 中的N端氨基、側(cè)鏈氨基、側(cè)鏈駿基、C端駿基、組氨酸側(cè)鏈咪挫基中至少一個(gè)與一種具有式 (I)的綴合物綴合； K1-K2 (I) 其中K1為包含DPP-4酶抑制劑的修飾基團(tuán)，K2為間隔物，并且K2末端與主鏈綴合；K1優(yōu)選為：
2-畑2為DPP-4酶抑制劑【包含Sitagliptin(簡(jiǎn)寫(xiě)為SiXVildagliptin(簡(jiǎn)寫(xiě)為VI)、Saxagliptin(簡(jiǎn)寫(xiě)為SA)等】； n為0-14的整數(shù)； X是C、N或0 ; Y是0或S; R優(yōu)選為：
K2優(yōu)選為W下通式所描述的化合物： ① （AEEA)a-Xaa7-Xaa8 -Xaa9 - (AEEA)b 上述所設(shè)及的AEEA{[2- (2-氨基）己氧基]己氧基己酸}結(jié)構(gòu)為
a為0-8的整數(shù)；b為0-6的整數(shù)； Xaa7 選自；Glu、Gin、Phe、Tyr或缺失； Xaa8選自；Asn、Asp、T虹或缺失； Xaa9 選自；Lys、Asn、Ser、切s或缺失； ② -(邸2)pCO-XaalO-，為直鏈或分支脂肪酸的酷基與氨基酸殘基相連 上述所設(shè)及的P為4-30的整數(shù)； XaalO選自；Glu、Asp、Gln或缺失； 化合物結(jié)構(gòu)示例：


權(quán)利要求書(shū)和說(shuō)明書(shū)中所使用的縮寫(xiě)的含義列于下表中；

2、制備方法 (1) 綴合物的制備方法 ①K1的制備； A) 稱取SI(leq)和了二酸?。╨eq)，用冰醋酸（2mol/L)溶解，50°C反應(yīng)過(guò)夜； B) 反應(yīng)液加入己酸己醋中，用水洗掉醋酸，濃縮，烘干，得到產(chǎn)品； ②K1-K2的制備； A) 按照所需要的K2,用固相合成的方法合成K2 ; B) 繼續(xù)固相偶聯(lián)K1 ; C) 將膚樹(shù)脂切割，處理，得到綴合物； (2) 主鏈的制備方法 A) 2-CTC樹(shù)脂用DCM洗漆2-3次，用DCM溶脹； B) 稱取N端Fmoc保護(hù)的氨基酸（3eq)，用DCM溶解(氨基酸濃度為0. 3mol/L)，加入 DIEA(3eq)，活化5分鐘，加入反應(yīng)柱，于25-30°C反應(yīng)20-2化； C) 用嗽晚和DMF體積比為1:4的混合液（DBLK)脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘； D) 重復(fù)步驟A、B、C，但是縮合劑改為HOBt(3. 3eq)和DIC(3. 3eq)，溶劑改為DMF，0-5°C 活化5分鐘，加入反應(yīng)柱，于25-30°C反應(yīng)2.化，按照所述的氨基酸序列，逐個(gè)偶聯(lián)相應(yīng)的氨 基酸，并將需要連接綴合物的側(cè)鏈駿基做成節(jié)醋，繼續(xù)偶聯(lián)直到序列中最后一個(gè)氨基酸偶 聯(lián)完成； E) 得到的樹(shù)脂用切割液（TFA和DCM體積比為1:99)切割，將多膚從樹(shù)脂上切割下來(lái)， 用水洗掉溶液中的TFA，濃縮，得到切割的主鏈粗膚；或?qū)?shù)脂用TFA裂解，將多膚從樹(shù)脂上 切割下來(lái)，并脫掉所有側(cè)鏈保護(hù)基，己離沉淀，得到裂解的主鏈粗膚； (3 )側(cè)鏈駿基、C端駿基和綴合物的連接方法 A) 用氨解的方法脫除切割的主鏈粗膚的側(cè)鏈駿基保護(hù)基芐基； B) 在駿基上偶聯(lián)Boc-己二胺，稱取Boc-己二胺（1.leq)，降溫至-5-0 °C，加入 DCC(leq)，投料，室溫反應(yīng)過(guò)夜； C) 用TFA裂解樣品，己離沉淀，得到粗膚； D) 稱取綴合物（leq)，將其合成為活性醋； E) 稱取粗膚（leq),溶于S己胺中，調(diào)整抑為9-11，加入綴合物活性醋，室溫反應(yīng) 20min，加水終止反應(yīng)，調(diào)抑為7-8,得到綴合物連接的粗膚； (4)、N端氨基、側(cè)鏈氨基、組氨酸側(cè)鏈咪挫基和綴合物連接的方法 A) 稱取綴合物（leq)、將其合成為活性醋； B) 稱取裂解的主鏈粗膚（leq)，溶于S己胺中，調(diào)整抑為9-11，加入綴合物活性醋，室 溫反應(yīng)20min，加水終止反應(yīng)，調(diào)抑為7-8,得到綴合物連接的粗膚； (5)、純化方法 A) 用C18色譜柱，W0. 1%TFA水溶液為流動(dòng)相A，己膳為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫，梯度 為30min內(nèi)流動(dòng)相B的體積比例從30%升至70%，收集饋分，凍干得到最終產(chǎn)品； B) 用HPLC方法檢測(cè)其純度和含量，用質(zhì)譜儀和E血an降解分析其序列； 4、 所使用的儀器設(shè)備 多膚合成儀；美國(guó)CsBioCS336X研究用多通道多膚合成儀； HPLC;日本島津LC-15C高效液相色譜； 色譜柱：YMC-Pack 0DS-A-服lOum200A4.6mm*250mm; 質(zhì)譜儀；AB SCIEX5800MALDI-TOF-TOF ; 5、 含義說(shuō)明 (1)膜高血糖素樣膚1 (GLP-1)是由腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞分泌的一種十分重要的腸促膜 島素，其在體內(nèi)的主要生理學(xué)作用包括進(jìn)食后刺激膜島素的分泌和釋放，促進(jìn)膜腺0細(xì)胞 的增殖并抑制其調(diào)亡，抑制膜高血糖素的分泌，抑制胃的排空，促進(jìn)飽食感產(chǎn)生等。
[0006] (2)GLP-1(7-37)膚序?yàn)?；HAEGT-FTSDV-SSYLE-EQAAK-EFIAW-LVKGR-G (3)DPP-4是一種細(xì)胞表面的絲氨酸蛋白酶。可溶性的DPP-4具有酶活性，其主要作用 是優(yōu)先將氨基末端第2個(gè)氨基酸為丙氨酸或脯氨酸的寡膚的氨基末端前兩個(gè)氨基酸剪切 去除。
[0007] (4)類似物：設(shè)及多膚的術(shù)語(yǔ)"類似物"是指母體膚的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被另 一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基取代，和/或母體胎的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失，和/或向其中母 體膚添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
[000引（5)衍生物：設(shè)及多膚的術(shù)語(yǔ)"衍生物"表示經(jīng)化學(xué)修飾的膚或其類似物，其中至少 一個(gè)取代基不存在于未經(jīng)修飾的膚或其類似物中，即表示已經(jīng)經(jīng)共價(jià)修飾的膚。
[0009] (6)本發(fā)明中所指的"綴合物"是指可與多膚W共價(jià)的形式連接的修飾基團(tuán)，所述 的綴合物包括但不限于上文所述的例子。
[0010] (7)本發(fā)明的膚可W是藥學(xué)上可接受的鹽的形式。該些鹽例如包括，但不限于，醋 酸、乳酸、馬來(lái)酸、巧樣酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、班巧酸、苯甲酸、甲橫酸、甲苯橫酸。制備本發(fā) 明膚的鹽的典型方法在本領(lǐng)域是公知的，它可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的鹽交換法來(lái)完成。
【附圖說(shuō)明】 圖1為本發(fā)明制備工藝流程圖。
[0011] 實(shí)施例一；GLP-1衍生物的合成 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-A la-Lys{ N-e-{ N-a-【SI-C0-(細(xì)2) 2-C0-(AEEA)2】-Glu-y-(AEEA)3} }-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly- Arg-Gly 綴合物中間體一【（SI-C0-(CH2)2C00H)】的制備； 稱取SI90mg和了二酸酢22mg，用冰醋酸溶解，50°C反應(yīng)過(guò)夜； 然后用化C監(jiān)測(cè)反應(yīng)情況(氯仿；甲醇；醋酸=5 ; 1 ;2d)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%w上后，向 反應(yīng)液中加入己酸己醋，用水洗掉醋酸，己酸己醋層加入無(wú)水硫酸鋼干燥后，抽濾，收集濾 液，減壓真空濃縮成油狀，加入石油離結(jié)晶后，過(guò)濾，收集固體，固體在40°C鼓風(fēng)烘干，得到 產(chǎn)品lOOmg，收率約90%，HPLC檢測(cè)純度為99%。得到綴合物中間體一； 綴合物【N-a-【SI-C0-(邸2) 2-C0-(AEEA) 2】-G1u-丫-(AEEA)3】的制備： 2-CTC樹(shù)脂（替代度0. 25mmol/g) 265mg用D