一種鉛-血紅蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測領(lǐng)域，更具體地說，設(shè)及一種鉛-血紅蛋白馨合物及其制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血紅蛋白化emoglobin;皿；HGB)是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載氧的一種蛋白質(zhì)。是使 血液呈紅色的蛋白。人類紅細(xì)胞內(nèi)有S種正常血紅蛋白即化-A、A2及F?；?A是正常成人 紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白之主要成分，化-A2是次要成分約占2%，而化-F在正常成人或兒童之 紅細(xì)胞中占2-3%W下，化-F在胚胎十月開始產(chǎn)生為胎兒紅細(xì)胞之主要成分，足月新生兒 的紅細(xì)胞中化-F占70-80%，其余為化-A，二個(gè)月后占50%，四個(gè)月后少于10%，六個(gè)月 后大部消失。血紅蛋白除運(yùn)輸氧氣二氧化碳，還可W導(dǎo)致血管疫李和血管收縮。在體內(nèi)存 在的=種形式的血紅蛋白，氧合血紅蛋白、還原型血紅蛋白及高鐵血紅蛋白，其中氧合血紅 蛋白縮血管能力最強(qiáng)，而高鐵血紅蛋白幾乎沒有收縮血管活性。
[0003] 鉛（Pb)是一種常見的有毒金屬及環(huán)境污染物，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中，包括 冶煉鍛造、鉛電池生產(chǎn)、汽油添加劑的生產(chǎn)過濾中等，與人們生活息息相關(guān)。對于普通人群， 主要是通過吸入鉛污染的空氣，或飲用W鉛壺或鉛錫壺盛裝的酒，甚至使用或?yàn)E用含鉛的 藥物治療慢性疾病而攝入鉛。越來越多的研究證明鉛可W對機(jī)體造成急性、慢性損傷，甚至 導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。美國毒物與疾病登記署公布研究表明，鉛是一種全身性毒物，可W影響神 經(jīng)、造血、內(nèi)分泌、免疫、生殖、肝臟、腎臟等組織器官，國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)（IARC)也將鉛及 其化合物列為第2B類人致癌物?？梢娿U對機(jī)體的影響及其重要，不可忽視。
[0004] 鉛與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密化可W與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對鉛毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到鉛與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認(rèn)為是了解鉛的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對鉛和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鉛與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與鉛之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對于鉛與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對鉛污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉛-血紅蛋白馨合物及其制 備方法，并建立鉛-血紅蛋白馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測鉛-血紅蛋白馨 合物在評價(jià)一個(gè)地區(qū)鉛污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人群血清中鉛-血紅蛋白 馨合物可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受鉛污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)鉛污染程度。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鉛-血紅蛋白馨合物，鉛 離子與血紅蛋白通過琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0007] 本發(fā)明還提供一種上述的鉛-血紅蛋白馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0008] A)鉛與血紅蛋白的馨合反應(yīng)；在提純源于人體的血紅蛋白或按照生物學(xué)方法重 組的血紅蛋白中加入鉛離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0009] B)純化鉛-血紅蛋白馨合物的提??；采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反 應(yīng)的血紅蛋白W及多余的鉛離子，即得鉛-血紅蛋白馨合物。
[0010] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0011] (1)溶解樣品；向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鉛-血紅蛋白馨 合物復(fù)溶；
[001引 似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與血紅 蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0013] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，血紅蛋 白與填料特異性結(jié)合；
[0014] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[0015] (5)收集：收集洗脫液I ;
[0016] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0017] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉛特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0018] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0019] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[0020] (10)收集；收集洗脫液II;
[002。 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鉛-血紅蛋白馨合物。
[0022] 其中，上述鉛-血紅蛋白馨合物的制備方法，還包括步驟C);對鉛-血紅蛋白馨合 物的鑒定；
[0023] 其中，步驟C)中具體如下；
[0024] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[00巧](2)加樣；取步驟B)中提取純化得到的鉛-血紅蛋白馨合物，加入稀釋緩沖液，并 混勻，然后加樣于樣品槽中；
[002引 做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0027] (4)檢測；在膠床上找出含鉛的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鉛W及檢測鉛的含量。
[0028] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉛-血紅蛋白馨合物在制備檢測人體內(nèi)鉛-血紅蛋白 馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉛-血紅蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。
[0030] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲血紅蛋白的物質(zhì)或捕獲鉛 的物質(zhì)。
[0031] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鉛-血紅蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述的 鉛-血紅蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對樣品進(jìn)行檢測；酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免 疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鉛-血紅蛋白 馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉛-血紅蛋白馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鉛-血紅 蛋白馨合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合 等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0032] 實(shí)施本發(fā)明的鉛-血紅蛋白馨合物及其制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效果：
[0033] 1.本發(fā)明首次體外合成鉛-血紅蛋白馨合物；
[0034] 2.本發(fā)明首次提出鉛-血紅蛋白馨合物可用于制備檢測血樣中鉛-血紅蛋白馨合 物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[00巧]3.本發(fā)明建立了鉛-血紅蛋白馨合物的定性定量檢測方法，W便定量檢測鉛-血 紅蛋白馨合物在評價(jià)一個(gè)地區(qū)鉛污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人群血清中 鉛-血紅蛋白馨合物可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受鉛污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū) 鉛污染程度。本發(fā)明建立的鉛-血紅蛋白馨合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使 檢測的重復(fù)性得到大大提高。
【附圖說明】
[0036] 圖1為本發(fā)明所述的鉛-血紅蛋白馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0037]圖2為本發(fā)明所述的鉛-血紅蛋白馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分析 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0039] 本發(fā)明除特別說明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過市購方式 獲得：
[0040] 磯酸鹽溶液為0. 05-0.Imol/L化2冊〇4溶液或0. 5-lmol/L化2冊〇4溶液；
[0041] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0042] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0043] 捕獲血紅蛋白的物質(zhì)為上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)的型號為KAY0043的抗 血紅蛋白抗體；其中，本發(fā)明所述與血紅蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗皿抗體、抗血紅蛋白抗 體均為捕獲血紅蛋白的物質(zhì)；
[0044] 捕獲鉛的物質(zhì)為己傲得生物科技有限公司生產(chǎn)的型號為AP7019的鼠抗化mAb; 其中，本發(fā)明所述與鉛特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗Pb抗體、抗鉛抗體、鉛抗均為捕獲鉛的物質(zhì)；
[0045] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0046] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0047]紅細(xì)胞裂解液的配方如下；139.6mmol/LNH4CI，16. 96mmol/LTris，用Imol/L肥 1 調(diào)抑至7.2;
[0048]洗漆液為含有KH2PO40. 2mg/ml、化2冊〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑為 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[004引封閉液為1% -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0050]稀釋緩沖液為含 1. 5mg/mL化2〇)3、2. 93mg/mlNaHC〇3的PH為 9.6的 0. 05M碳酸 鹽緩沖液；
[0051] 酶標(biāo)抗體為HRP酶標(biāo)抗體；
[0052] 終止液為：將21. 7ml的2M&8〇4定容至200ml的d地2〇中；
[0053] 洗脫液為含木瓜蛋白酶的PH為8. 0的0.Imol/LTris-HCL緩沖液；
[0054] 酸化劑為硝酸；
[00巧]上樣緩沖液為含有 1MTris-HCl(pH6.8) 15. 5mL、1 %漠酪藍(lán) 2. 5mL、ddH2〇7mL、甘 氨酸 25血的Samplebuffer巧)〇 ;
[0056]電泳緩沖液為含Tris3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH為6.8的d地2〇溶液。
[0057] 本發(fā)明提供一種