一種大麗輪枝菌菌種保藏方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病原真菌學(xué)研宄領(lǐng)域，具體涉及一種大麗輪枝菌菌種保藏方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物病原性輪枝菌是指能夠造成植物病害、利用柯赫法則可以加以鑒定的一類可培養(yǎng)輪枝菌屬真菌病原物。輪枝菌屬(Verticillium)由Nees在1817年建立，能夠腐生或寄生在昆蟲、線蟲、真菌和植物上。其中危害植物的種類主要包括黑白輪枝菌VerticiUiunialbo-atrum Reinke and BertholcU 大剛輪枝菌 V.dahliae Klebahn、三體輪枝菌 V.tri corpus Isaac、云狀輪枝菌 V.nub Hum Pethybridge 和 V.theobromae (Turconi)Mason and Hughes等植物病原性輪枝菌，它們均可造成植物病害的發(fā)生，其中以同為土壤習(xí)居菌的大麗輪枝菌和黑白輪枝菌危害為最，屬于我國重要植物檢疫對象。對植物病原性輪枝菌真菌進(jìn)行鑒定和后續(xù)研宄，一般首先要進(jìn)行分離保存工作，分離的真菌采用適當(dāng)方法保存，能夠保持它的生活力、原有培養(yǎng)性狀和致病性，并避免雜菌和螨類等的污染，為后續(xù)工作提供重要保證。傳統(tǒng)上，輪枝菌種類鑒定的主要依據(jù)是微菌核、厚垣孢子、休眠菌絲的有無等。一般認(rèn)為黑白輪枝菌僅能產(chǎn)生黑色的休眠菌絲，大麗輪枝菌能產(chǎn)生微菌核卻不產(chǎn)生休眠菌絲，三體輪枝菌可以同時產(chǎn)生黑色的休眠菌絲、微菌核及厚垣孢子，云狀輪枝菌只產(chǎn)生厚垣孢子等。然而，不同輪枝菌常因保存條件的影響而發(fā)生變異，如保存方式不同和保存時間不同等，其形態(tài)變異主要表現(xiàn)為菌落形態(tài)的改變和產(chǎn)休眠結(jié)構(gòu)能力的喪失等，這對于輪枝菌相關(guān)研宄帶來了極大不便。
[0003]植物病原性輪枝菌常用保存方法主要包括定期移植保藏法、液氮超低溫保藏法、冷凍干燥保藏法、-80°C低溫凍結(jié)保藏法等。定期移植保藏法是常用保存方法，如PDA試管斜面保存即屬于此類方法，但該方法保存菌種發(fā)生變異可能性較大，且容易受到螨類污染。液氮超低溫保藏法適用于絕大多數(shù)可以純培養(yǎng)的絲狀真菌的長期保藏，可完全抑制真菌代謝活動，但是需要不間斷使用液氮和一定保存設(shè)施，操作繁瑣，費用較高。冷凍干燥保藏法的原理是使微生物快速冷凍后通過升華作用將水分除去，該方法所需設(shè)備較多，步驟較多。_80°C低溫凍結(jié)保藏法同樣需要超低溫冰箱設(shè)備進(jìn)行保存，能夠保持較長時間真菌活性，但是要注意日常冰箱維護(hù)保養(yǎng)工作，否則極易造成菌種活性喪失，且需配置一定保護(hù)劑進(jìn)行配合使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種大麗輪枝菌菌種保藏方法，該方法操作簡單，設(shè)備依賴性低，保存期長，費用低廉，占用存儲空間少，不會對病菌致病性以及形態(tài)特征造成影響，一般實驗室均可滿足其條件，便于應(yīng)用和推廣。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是一種大麗輪枝菌菌種保藏方法，步驟如下: a、取待保存大麗輪枝菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5~10天，形成可保存菌落；
1^、將1.2 mL滅菌雙蒸水加入直徑1.2 cm、高度5 cm的圓柱狀帶螺帽凍存管中，輕輕擰住螺帽，放入紙質(zhì)凍存盒中；
C、將裝有凍存管的凍存盒放入水蒸氣滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，滅菌條件為121 °0高壓滅菌20 min，重復(fù)滅菌2次；
d、用解剖刀將上述可保存菌落連同PDA培養(yǎng)基切割成為直徑約3.5-4.5 mm的菌種塊，取菌種塊4~8塊放入滅菌好的凍存管中，擰緊凍存管螺帽；
e、上下晃動凍存管，使所有菌種塊浸沒入滅菌雙蒸水中；
f、用記號筆在凍存管上標(biāo)記好所保存大麗輪枝菌菌株編號，將其放入凍存盒中，凍存盒在4 °0冷藏箱內(nèi)保存。
[0006]g、需用時，用挑針挑取帶有大麗輪枝菌的PDA小塊，置于PDA上活化培養(yǎng)。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點在于一種大麗輪枝菌菌種保藏方法，該方法通過以滅菌雙蒸水作為保存液體，配合凍存管和普通冷藏箱的使用，能夠很好的保持所保存大麗輪枝菌菌株的生活力和原有性狀，并避免了雜菌和螨類的污染，節(jié)省了保存體積，操作十分簡單，對設(shè)備依賴性低，保存期可達(dá)3年以上，無需進(jìn)行繁瑣的轉(zhuǎn)管保存等操作，所使用凍存管、滅菌雙蒸水等原材料費用低廉，一般實驗室均可滿足該方法所需條件，便于大范圍應(yīng)用和推廣。
【具體實施方式】
[0008]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0009]實施例1
1、通過在PDA平板上培養(yǎng)大麗輪枝菌菌株V12 10天，獲得V12的純培養(yǎng)PDA平板；2、將1.2 mL滅菌雙蒸水加入直徑1.2 cm,高度5 cm的圓柱狀帶螺帽凍存管中，輕輕擰住螺帽，放入紙質(zhì)凍存盒中；3、將裝有凍存管的凍存盒放入滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，滅菌條件為121°〇高壓滅菌20 min，重復(fù)滅菌2次；4、用解剖刀將培養(yǎng)好V12菌落連同PDA培養(yǎng)基切割成為直徑約4 mm左右(3.5-4.5 mm)的菌種塊，取4~8塊菌種塊放入滅菌好的凍存管中，擰緊凍存管螺帽；5、上下晃動凍存管，使所有放入V12菌株P(guān)DA小方塊浸沒入滅菌雙蒸水中；6、用記號筆在凍存管上標(biāo)記好所保存V12的編號，將其放入凍存盒中；7、將凍存盒放入4 °〇冷藏箱中，進(jìn)行長期保存；8、需用時，用挑針挑取帶有V12的PDA小塊，置于PDA上活化培養(yǎng)。
[0010]上述大麗輪枝菌菌種保藏方法也可應(yīng)用于黑白輪枝菌、三體輪枝菌、云狀輪枝菌等，在此不一一列舉。
【主權(quán)項】
1.一種大麗輪枝菌菌種保藏方法，其特征在于步驟如下: a、取待保存大麗輪枝菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5~10天，形成可保存菌落； b、將1.2 mL滅菌雙蒸水加入直徑1.2 cm、高度5 cm的圓柱狀帶螺帽凍存管中，輕輕擰住螺帽，放入紙質(zhì)凍存盒中； c、將裝有凍存管的凍存盒放入水蒸氣滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，滅菌條件為121°0高壓滅菌.20 min，重復(fù)滅菌2次； d、用解剖刀將上述可保存菌落連同PDA培養(yǎng)基切割成為直徑約3.5-4.5 mm的菌種塊，取4~8塊菌種塊放入滅菌好的凍存管中，擰緊凍存管螺帽； e、上下晃動凍存管，使所有菌種塊浸沒入滅菌雙蒸水中； f、用記號筆在凍存管上標(biāo)記好所保存大麗輪枝菌菌株編號，將其放入凍存盒中，凍存盒在4 °0冷藏箱內(nèi)保存。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大麗輪枝菌菌種保藏方法，該方法通過以滅菌雙蒸水作為保存液體，配合凍存管和普通冷藏箱的使用，能夠很好的保持所保存大麗輪枝菌菌株的生活力和原有性狀，并避免了雜菌和螨類的污染，節(jié)省了保存體積，操作十分簡單，對設(shè)備依賴性低，保存期可達(dá)3年以上，無需進(jìn)行繁瑣的轉(zhuǎn)管保存等操作，所使用凍存管、滅菌雙蒸水等原材料費用低廉，一般實驗室均可滿足該方法所需條件，便于大范圍應(yīng)用和推廣。
【IPC分類】C12N1/04, C12R1/645
【公開號】CN104988064
【申請?zhí)枴緾N201510351278
【發(fā)明人】段維軍, 蔡磊, 郭立新, 段麗君, 陳先鋒
【申請人】寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年6月24日