一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢桿菌及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物與生物技術(shù)領域，具體設及一株從市售黑胡椒表面篩選出的具 有高真菌抑制活性的解淀粉芽抱桿菌及其在黑胡椒儲藏中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 絲狀真菌和酵母是導致發(fā)酵乳制品、谷類食品、果蔬W及糧食等食品發(fā)生腐敗的 普通微生物類群。據(jù)估計，全球5%~10%的食品損失是由真菌引起的。在西歐，每年由 霉菌引起的面包腐敗導致的經(jīng)濟損失高達20億英鎊。據(jù)報道青霉和曲霉是引起食品腐敗 的主要真菌微生物。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，由于農(nóng)作物病蟲害發(fā)生普遍和危害嚴重，每年 因病蟲害造成的糧食損失1，000萬噸W上，其中80%W上的農(nóng)作物病害是由真菌侵染引起 的。黃曲霉（Aspergillusflavus)是一種常見的霉菌，是子囊菌亞口（Ascomycotina)、曲 霉屬（Aspergillus) -種常見的腐生型好氧真菌，不僅污染食品和飼料，而且可引起人類 和動物的多種疾病。黃曲霉的次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素具有很強的毒性，研究報道其具有 致癌性、致突變、致崎性，降低免疫力，并可引起肝部損傷等危害。目前，防治黃霉菌及其毒 素污染的重要手段是使用抗生素及化學制劑，但隨之導致耐藥性細菌產(chǎn)生及抗生素殘留等 問題，對食品安全造成重大影響，因此亟需開發(fā)新的手段來進行霉菌及其毒素污染的防治。 越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，某些細菌，包括芽抱桿菌，可抑制霉菌的生長及其產(chǎn)毒，在防治黃曲 霉及其毒素污染方面顯現(xiàn)出廣闊的應用前景。許多研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽抱桿菌炬acillus amyloliquefaciens)在生長過程中可W產(chǎn)生一系列抑制真菌和細菌活性的代謝物，已證實 的抑菌物質(zhì)包括抑菌蛋白類、脂膚類抗生素、大環(huán)類醋類、膚類、聚酬化合物等，在抑制病原 菌、環(huán)境保護、動物生產(chǎn)等方面已顯示出益生菌的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽抱桿菌，可 減輕黑胡椒儲藏中真菌及其毒素污染，而避免或減少使用化學抑菌劑和抗生素來抵抗霉菌 對黑胡椒的侵染，為開發(fā)無殘留、安全、高效的食品保護劑提供新的手段，W延長食品的貨 架期，提高食品安全性。
[0004] 本發(fā)明從市售黑胡椒體表分離出一株解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciensF1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中屯、（CGMCC)， 地址；北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，其菌種保藏編號為： CGMCCNo.10942,保藏日期為2015年6月1日，菌種的分類命名為解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciensF1。
[0005] 本發(fā)明中的解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensFI具有W下生物學特 性：
[0006] (1)形態(tài)特征：經(jīng)革蘭氏染色后在生物顯微鏡下觀察，菌體為紫色陽性，短桿狀， 內(nèi)生芽抱；透射電鏡下可清晰地看到菌體呈典型的椿狀桿菌，大小約30ym，單生，有鞭毛， 見圖1;
[0007] (2)菌落特征；將篩選出的括抗菌FI先在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)2化，可觀察 到有菌膜產(chǎn)生；后在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)4她后觀察，菌落較大 約6. 0mm，表面膜狀有權(quán)皺，側(cè)面高凸起，幼齡菌挑起十分粘稠，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌落 分散成雪花狀，灰白色不透明，見圖1 ;
[000引 做生理生化特征；不產(chǎn)生嘲噪，V-P試驗、甲基紅試驗均為陽性；氧化酶、接觸酶、 淀粉酶、卵磯脂酶亦均為陽性；糖發(fā)酵試驗結(jié)果為，不能利用甘露醇和乳糖，可發(fā)酵麥芽糖、 庶糖、葡萄糖但不產(chǎn)氣；
[0009] (4)生長特性；對菌株F1進行生長特性研究，獲得其最適生長溫度為25-32°C，最 高可耐受45°C高溫，最低可耐受20°C?？缮L抑值為5. 0-8.0,最適生長抑為5. 5。耐鹽 性試驗表明，菌株可在低于10%氯化鋼濃度的培養(yǎng)基中生長，最適生長鹽濃度為5% ;
[0010] (5)抗真菌特性；抑制黑曲霉、白曲霉和寄生曲霉、黃曲霉等真菌生長及產(chǎn)毒；能 廣抗真菌蛋白。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：
[0012] 芽解淀粉芽抱桿菌炬acillusamyloliquefaciens)在生長過程中可W產(chǎn)生一系 列抑制真菌和細菌活性的代謝物，已證實的抑菌物質(zhì)包括抑菌蛋白類、脂膚類抗生素、大環(huán) 類醋類、膚類、聚酬化合物等，在抑制病原菌、環(huán)境保護、動物生產(chǎn)等方面已顯示出益生菌的 用途，W芽解淀粉芽抱桿菌及其代謝產(chǎn)物研發(fā)新型抑菌劑和微生態(tài)劑對食品、飼料等加工、 儲藏過程中真菌的生物防治具有潛在價值和廣闊前景。
[0013] 本發(fā)明的解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensF1對黑曲霉、白曲霉和 寄生曲霉、黃曲霉具有較強抑制作用。本發(fā)明的菌株能產(chǎn)抗真菌蛋白，該蛋白具有較強的抑 穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，其能有效降低黃曲霉浸染黑胡椒模型中的黃曲霉毒素含量。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明菌株BacillusamyloliquefaciensF1的菌落形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)示意 圖（注A，革蘭氏染色；B，平板培養(yǎng)單菌落；圖C和D，掃描電鏡結(jié)果）。
[0015] 圖2為本發(fā)明菌株BacillusamyloliquefaciensF1發(fā)酵上清液對毛霉的抑制作 用示意圖。
[0016] 圖3為本發(fā)明菌株BacillusamyloliquefaciensF1發(fā)酵液及其超濾液對黃曲霉 的抑制作用示意圖。
[0017] 圖4為本發(fā)明菌株BacillusamyloliquefaciensF1抗菌蛋白對黃曲霉菌絲生產(chǎn) 的影響示意圖。
【具體實施方式】
[001引 實施例1BacillusamyloliquefaciensF1對霉菌生長的抑制作用
[0019] 霉菌培養(yǎng)及抱子懸液制作；將保存在PDA斜面培養(yǎng)基上霉菌接種到PDA平板，28°C 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4d后，加入一定量的無菌PBS緩沖液，用滅菌大槍頭尖頭輕刮培養(yǎng)基上的抱 子，然后將含有霉菌抱子和菌絲的混懸液通過滅菌八層紗布的藍蓋瓶中W過濾掉霉菌菌 絲，禍旋震蕩，10倍稀釋法分別稀釋10、100、1000倍后，血球計數(shù)板計數(shù)，然后將計數(shù)好的 霉菌抱子原液用無菌PBS緩沖液統(tǒng)一調(diào)整至lO5個/mL，4°C冰箱貶藏備用。
[0020] 抑菌率測定；將分離并保種的BacillusamyloliquefaciensF1，4°C解凍，吸取 100yL菌液于5血營養(yǎng)肉湯或MRS肉湯中培養(yǎng)活化，2化后取菌液600化/min離屯、lOmin， 0.22ym陽S水系濾膜過濾除菌收集上清液。吸取ImL無菌上清液傾注至無菌平板內(nèi)，倒 入lOmLPDA培養(yǎng)基輕輕混勻，待培養(yǎng)基冷卻凝固，用直徑為6mm打孔器在中央打孔，向孔中 注入20yL濃度為104個/mL的霉菌抱子懸液，空白培養(yǎng)基代替上清液作為對照，30°C培養(yǎng) 3d后測霉菌直徑，每組=個平行，W抑菌率（％ )為括抗細菌上清液的抑菌效果，抑菌率的 計算公式為；抑菌率（％ )=(對照組直徑一試驗組直徑）X100/對照組直徑。
[0021] 在上述測試條件下，BacillusamyloliquefaciensF1發(fā)酵液對黃曲霉、毛霉、黑 曲霉、和寄生曲霉的抑菌率分別達到75. 2 %、62. 8%、66. 3%和14. 3%。其中，Bacillus amyloliquefaciensF1發(fā)酵液對毛霉的抑菌效果見圖2。
[0022] 實施例2BacillusamyloliquefaciensF1發(fā)酵液及其超濾液的抑菌特性
[0023] 分別選取膜截留分子量100ku、30ku和3ku的超濾膜對菌株F1發(fā)酵上清液進行超 濾，各部分超濾液的抑菌活性如圖3所示，lOOku濾過液的抑菌性略高于原上清液的抑菌活 性；30ku濾過液和3ku濾過液的抑菌活性分別下降65. 31 %和80. 61 %。綜上，菌株F1所 產(chǎn)抗真菌物質(zhì)分子量范圍在30ku~lOOku。為進一步證實該物質(zhì)是否為蛋白類物質(zhì)，分別 選用堿性蛋白酶、膜蛋白酶和蛋白酶K，W菌株F1超濾液（30ku~lOOku)為底物進行酶解 后檢測其抑菌活性。經(jīng)過=種蛋白酶處理后，超濾液（30ku~lOOku)的抑菌活性均出現(xiàn)不 同程度的下降，其中膜蛋白酶處理后的超濾液的抑菌活性下降了 70%，結(jié)果表明，抗菌超濾 液對蛋白酶較為敏感，初步確定30ku~lOOku超濾液中含有能抑制黃曲霉的蛋白類抗菌物 質(zhì)。
[0024] 在溫度50°C-70 °C范圍內(nèi)，抗菌超濾液對黃曲霉的抑菌活性變化不顯著 (P> 0. 05);當抗菌超濾液溫度高于70°C時，隨著溫度的升高