的影響無明顯的規(guī)律，即效應(yīng)不顯著。
[008引 2、E加巧光染色法檢測細胞的增殖能力
[0084] 為了更準確且直觀的片段細胞增殖情況，本發(fā)明還引入了E加巧光染色的方法檢 測了PCSK9過表達細胞（實施例2中的LV6-D374Y組）和空白對照細胞（實施例2中的 LV6-NC組）的增殖能力，通過計數(shù)E加陽性細胞核與陰性細胞核即能迅速了解細胞的增殖 水平。E加細胞增殖檢測試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司。HepG2細胞的增殖檢 測流程參照試劑說明書進行，具體操作如下：
[0085]1化加標記：用DMEM完全培養(yǎng)基按1000 ; 1的體積比稀釋E加溶液（試劑A)，制備 適量50yME加培養(yǎng)基；每孔加入100yL50yME加培養(yǎng)基解育2小時，吸出培養(yǎng)基并用 PBS洗1-2次，每次5min。細胞固定：每孔加入50yL細胞固定液（4%多聚甲醒），在室溫解 育30min，倒掉固定液?？准尤?0yL2mg/mL甘氨酸溶液，脫色搖床解育5min，用100化 PBS脫色搖床清洗5min;每孔加入100yL滲透劑（含有0. 5%TritonX-100的PB巧脫色 搖床解育lOmin;PBS清洗5min。
[008引^Apollo染色海孔加入100化的IxApollo液染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床 解育30min后，棄染色反應(yīng)液；加入100yL滲透劑（0. 5%TritonX-100的PB巧脫色搖床 清洗2-3次，每次lOmin，棄滲透劑；DNA染色；用去離子水按100 ;1的體積比稀釋試劑F，制 備適量IX化echst33342反應(yīng)液，避光保存；每孔加入100yLIX化echst33342反應(yīng)液， 避光、室溫、脫色搖床解育30min后，棄染色反應(yīng)液；每孔每次加入100yLPBS清洗1-3次； 染色完成后立即進行觀測。每孔細胞隨機取5個視野拍照，計算增殖細胞的平均值。定量 實驗重復(fù)測定=次W上，結(jié)果取均值。
[0087] 統(tǒng)計結(jié)果和巧光圖片顯示，LV6慢病毒介導(dǎo)的PCS腳D374Y突變體過表達對化pG2 細胞的增殖能力無顯著的影響（圖2中C)。
[008引 3、有絲分裂標記蛋白PCNA的表達水平的檢測
[0089] 本發(fā)明的發(fā)明人還同時檢測了PCSK9過表達細胞（實施例2中的LV6-D374Y組） 和空白對照細胞（實施例2中的LV6-NC組）的細胞核與細胞質(zhì)中有絲分裂標記蛋白PCNA 的表達水平，western-blot檢測方法同實施例2, 一抗為PCNAR油bitmAb(CST，#13110)， 二抗為anti-r油bitIgG,HRP-linkedAntibody(CST，#7074)?；痯G2 蛋白的分類提取使用 Nc-細胞核/漿蛋白抽提試劑盒進行（康為世紀，CW0199)。具體方法如下：
[0090] 1)收集細胞，計數(shù)。
[0091] 2)在蛋白抽提前取出抽提試劑Nc-試劑A和化-試劑C進行預(yù)冷，按照1:99比例 加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990yL抽提試劑中加入10yL蛋白酶抑制劑混合物），使 蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成IX工作液。在進行蛋白抽提前2-3min內(nèi)加入蛋白 酶抑制劑混合物。
[009引 3) 1X107細胞中加入1血Nc-試劑A(使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），禍旋5s W充分混勻，冰上解育20min。各種細胞的特性不同，需要根據(jù)不同細胞的特性調(diào)整Nc-試 劑A的用量，如果蛋白濃度小，按比例減少Nc-試劑A及后續(xù)Nc-試劑B、化-試劑C的用 量。
[0093] 4)加入55化，Nc-試劑B，禍旋5秒W充分混勻，冰上解育Imin。 4°C12, 000巧m(13, 400Xg)離屯、15min，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離屯、管 中，-20°C保存待測（此提取液為胞漿蛋白）。
[0094] 5)向上步所得的沉淀中加入500yLNc-試劑C(使用前加入蛋白酶抑制劑混合 物），禍旋5sW充分混勻，重懸沉淀，冰上解育40min，每隔lOmin禍旋混勻一次，每次約 15-30s〇
[0095] 6)41： 12,000巧111離屯、15111111，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離屯、管 中，-20°C保存待測（此提取液為胞核蛋白）。
[0096] 結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)不同基因型細胞間該蛋白的表達差異（圖2中D)，進一步從分子 水平證明了上述步驟1和2的結(jié)論。
[0097] 綜合W上1-3的結(jié)果，可見PCSK9蛋白D374Y突變型的過表達不影響化pG2細胞 的增殖。
[0098] 實施例4、人PCSK9基因的D374Y突變體的過表達顯著抑制化pG2細胞的遷移
[0099] 細胞遷移是細胞行使正常生物學(xué)功能的一個非常重要的性狀。有關(guān)PCSK9對肝癌 細胞遷移的研究，沒有明確的報道稱PCSK9的過表達是否會影響肝癌細胞的遷移，因此本 發(fā)明檢測了PCSK9的D374Y突變體對化pG2細胞的遷移能力。
[0100] 1、細胞劃痕愈合實驗檢測HepG2細胞的遷移能力
[0101] 采用細胞劃痕愈合實驗檢測了PCSK9過表達細胞（實施例2中的LV6-D374Y組） 和空白對照細胞（實施例2中的LV6-NC組）的遷移能力。具體操作如下：
[0102] 1)細胞培養(yǎng)：取PCSK9過表達細胞（實施例2中的LV6-D374Y組）和空白對照細 胞（實施例2中的LV6-NC組），用0. 05%膜酶消化，調(diào)節(jié)細胞濃度4XlOVmU接種于六孔 板，每組平行=個孔，加入DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2化，然后用10yg/血絲裂霉素C處理化， 使細胞分裂停滯。
[0103] 2)劃痕；用移液器10UL槍頭沿培養(yǎng)板底部間隔均勻平行劃出3道劃痕，用無血 清培養(yǎng)液清洗數(shù)次去除漂浮細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，并每2化拍照觀測劃痕愈合情況。
[0104] 如統(tǒng)計海孔取9個視野范圍拍照，定性比較劃痕間的相對減少面積。
[0105] 結(jié)果顯示，HepG2細胞的運動能力較弱，劃痕在10她后仍未能完全愈合。與LV6-NC 空白對照細胞相比，LV6-D374Y過表達細胞的劃痕愈合速度均要慢，暗示PCSK9的D374Y突 變體過表達可能會抑制化pG2細胞的遷移；具體參見圖3中A。
[0106] 2、transwell實驗檢測化pG2細胞的遷移能力
[0107] 采用transwell實驗檢測了PCSK9過表達細胞（實施例2中的LV6-D374Y組）和 空白對照細胞（實施例2中的LV6-NC組）的遷移能力。具體操作如下；
[0108] 1)收集培養(yǎng)在六孔板中的PCSK9過表達細胞（實施例2中的LV6-D374Y組）和 空白對照細胞（實施例2中的LV6-NC組），分別計數(shù)。用DMEM重懸細胞，按照1X1〇5個細 胞接種5ym聚碳酸醋濾器的上室中，體積為100-200化，下室加入600化DMEM完全培養(yǎng) 基，做好標記后放入37 °C的C〇2培養(yǎng)箱她。
[0109] 2)待解育完后，取出上室，去除上室的無血清培養(yǎng)基，PBS清洗1遍，5min。之后放 入4%多聚甲醒室溫固定lOmin。
[0110] 3)吸取上室的多聚甲醒，PBS清洗1遍，5min。
[0111] 4)用優(yōu)質(zhì)棉簽少量沾取PBS，力度適當擦去上室中殘留的未遷移過膜的細胞，避 免力度過大造成膜平面出現(xiàn)凹凸的權(quán)皺。
[011引 5)倒扣小室，向膜上滴加20yL濃度為1yg/mL的DAPI，避光室溫解育lOmin。
[0113] 6)去除室內(nèi)DAPI液，PBS清洗2遍，5min。
[0114] 7)用倒置巧光顯微鏡隨機選取10個視野，計數(shù)過膜細胞。定量實驗重復(fù)測定=次 W上，結(jié)果取均值。
[0115] transwe11實驗結(jié)果如圖3中B和C所示，與LV6-NC空白對照細胞相比，LV6-D374Y 過表達細胞的遷移速度顯著降低，證明PCSK9的D374Y突變體對化pG2細胞遷移的抑制作 用。
[0116] 實施例5、人PCSK9基因的D374Y突變體通過下調(diào)Erk蛋白的磯酸化水平而顯著抑 制化pG2細胞的遷移
[0117] 1、S種重要的小G蛋白的表達量和活性的檢測
[0118]細胞遷移與細胞骨架蛋白的動態(tài)重塑和信號傳導(dǎo)有著密切的關(guān)系。小G蛋白對骨 架蛋白的組裝具有重要的作用，因而檢測了PCSK9過表達細胞（實施例2中的LV6-D374Y 組）和空白對照細胞（實施例2中的LV6-NC組）中S種重要的小G蛋白，即rhoa、rac-l和 cdc42的表達量和活性。一方面，采用化ISA法進行了檢測，具體采用化oA(切toskeleton， #BK124)、Racl(切toskeleton，#BK128)、CDC42-GTPElisa(切toskeleton，#服127)試劑盒 進行。另一方面，對化oA、Racl、CDC42總蛋白進行了western-blot檢測。
[011引 （1化LISA法檢測
[0120] 將無血清培養(yǎng)化的PCSK9過表達細胞（實施例2中的LV6-D374Y組）和空白對照 細胞（實施例2中的LV6-NC組）培養(yǎng)板置于冰上，用預(yù)冷的ImL的PBS反復(fù)沖洗3遍后靜 置Imin，吸取剩余的PBS，每孔加入蛋白裂解液100yL(含ImM蛋白酶抑制劑）反復(fù)吹吸后 將細胞收集置于1. 5mL的EP管中冰上裂解lOmin，每5min縱禍震蕩10s，使細胞充分裂解， 裂解完成后，細胞裂解液在4°C，12,0(K)巧m離屯、lOmin，收集并分裝上清。根據(jù)試劑盒使用 說明，吸取10yL細胞裂解液于96孔板中，加入試劑盒中蛋白分析試劑290yL。靜置Imin 后于600nm檢測吸光0D值，并扣除去空白值后換算成濃度值。按照W下流程進行檢測： [012。 1)分裝120化裂解液于PCR管中，置于冰上，作為空白對照。
[012引 2)將24yL陽性蛋白液與96化裂解液混合置于PCR管中置于冰上，作為陽性對 照。
[012引 3)按需要將化ISA檢測板條