0)，充分懸浮，37 °C溫浴20分鐘。
[00引](4)加入10uL20mg/血溶菌酶，37°C溫浴20分鐘。
[002引 （5)加入1. 5化20mg/mL蛋白酶K，輕柔混勻。
[002引（6)加入15yL10%SDS，50°C水浴2小時至溶液澄清，期間輕輕顛倒混勻若干次。[0024] (7)加 2yL20mg/mLRNAse，65°C水浴 30 分鐘。
[00巧](8)用剪去尖頭的槍頭將上述溶液移到新的潔凈離屯、管中。
[0026] (9)在通風榻中加入250uL苯酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)，充分混勻，12000 rpm，4°C離屯、10分鐘，上清液轉移到新的離屯、管，重復一次。
[0027] (10)在通風榻中加入250yl氯仿；異戊醇（24 ;1)，充分混勻，12000巧m，4°C離 屯、10分鐘，上清液轉移到新的離屯、管。
[002引 （11)加入2. 5倍體積的提前預冷的無水己醇，輕搖，于-80°C沉淀DNA。12000巧m ，4°C離屯、15min。
[0029] (12)用1血70%冰己醇洗漆DM沉淀，然后在65°C，10min烘干。
[0030] (13)用30uLTE溶解，并于-20。C冰箱備用。
[00引]實施例4、樣本PCR擴增 W回收的上清液作為PCR反應的模板，PCR反應體系及反應條件： PCR反應體系； 表3A組PCR反應體系
表4B組PCR反應體系
反應結束后W2%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增情況。
[0032] 實施例5、巧片雜交、染色、上機 (1) 懸搖、超聲處理微球（已交聯(lián)探針）20秒W重懸之； (2) 配制混合微球工作液：用1. 5XTMAC雜交液將各組微球稀釋至150個All;(注； 每個反應需要33ul混合微球工作液） (3) 懸搖、超聲處理微球20秒W混勻工作液； (4) 向每個反應孔及空白對照孔中加入33ul工作液； (5) 向每個空白孔中加入17ulTE(P服.0);而向每個樣品孔中分別加入已生物素化的 擴增產(chǎn)物17ul; (6) 用槍上下吹吸數(shù)次W混勻各反應孔； (7) 蓋好反應板W防止揮發(fā)，將其置于95-100°C5分鐘W使PCR產(chǎn)物雙鏈變性； (8) 之后再將反應板置于52°C15分鐘； (9) 配制新鮮的顯色液；用lxTMAC雜交液將streptavidin-R-phycoeirt虹in(鏈霉 親和素-藻紅蛋白）配成2-4ug/ml;(注；每孔需75ul顯色液） (10) 用1XTMAC雜交液將1. 2um的Milliporefilterplate預濕一下，之后再負壓 抽空；之后將雜交好的反應液移入已預濕的孔中，用負壓抽空W去除上清；之后再每孔加 入75ul顯色液，并用排槍上下吹吸數(shù)次W重懸反應液；迅速將反應液移回PCR板中； (11) 將反應板再置于雜交溫度120r/min解育15分鐘； (12) 反應完成后，在52°C上，用Luminex100機器檢測； (13化lO-Plex檢測系統(tǒng)，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發(fā)微球基質的染料從而 對微球編號進行識別，綠色激光對微球表面結合的巧光染料進行識別，實現(xiàn)捕獲探針捕獲 的PCR產(chǎn)物的定量分析。
[0033] 在檢測時，同時WPCR陰性對照進行檢測作為檢測本底。對于每個檢測體系和 檢測本底，儀器輸出的數(shù)據(jù)是相應反應體系內一種編號微球群的巧光強度中位值(Median FluorescenceIntensity,MFI),也就是讀取的該種編號的微球群（〉100個）的每個微球 信號強度的統(tǒng)計平均值。結果判讀；當待檢測樣本的MFI值為其對應的檢測背景信號強度 的5倍W上時即判為陽性。
[0034] 實施例6巧片特異性檢測 特異性主要體現(xiàn)在我們所設計的10種菌的特異性探針只能與自己向對應的那種菌進 行雜交，而不能與另外9種或檢測范圍外的任何菌產(chǎn)生交叉反應。我們提取檢測范圍內10 種菌的基因組，經(jīng)過液相巧片方法，所得結果如表5和圖1所示。我們得到了 10個樣品與 10種探針雜交的巧光中位值，S/B即SampleMFI/BlankMFI，也就是在一次實驗中，每個樣 品所得的MFI與相對應的空白對照的MFI值的比率，我們規(guī)定當S/B乂時，結果就是陽性結 果。從下表看出，樣品與其相應探針雜交所得的MFI值較空白MFI值比率均大于5,而與其 他探針的S/B值低于5,其他范圍外的菌與所有探針的S/B值也均低于5。
[0035] 表5巧片特異性檢測結果
注；B為空白對照，^ /代表糞產(chǎn)堿桿菌，代表豬鏈球菌，公C代表蠟樣芽抱桿菌，# 7代表藤黃微球菌，《戈表馬紅球菌，7 戈表小腸結腸耶爾森菌，表奇異變形桿菌， ^n扭代表黑曲霉，^巧a代表黃曲霉，^ 代表煙曲霉。*11、*8等數(shù)字分別代表微球編 號，其所對應的探針號見表1。
[0036] 實施例7多種菌同時檢測 由于在實際環(huán)境檢測中，±壤往往存在不止一種致病菌，因此為了提高檢測巧片檢測 的效率，進行多種菌的同時檢測是必要的。我們在前期單重PCR驗證完每種探針的特異性 之后，將十種菌分為A、B兩組，詳細分組信息見表1，進行多重PCR擴增、雜交、檢測。W提取 的樣本基因組為模板，將基因組濃度稀釋至100ng/ul，建立五重PCR擴增體系，進行PCR擴 增。A、B多重PCR反應體系見表3、4。依據(jù)模板組合的不同，分別進行任意一種菌的檢測、 或同時進行任意兩種、任意S種、任意四種乃至5種菌的檢測。
[0037] 本研究10種致病菌分為A/B兩組，每組設及5種致病菌，即建立5重PCR擴增體 系的液相巧片檢測法。當在多重PCR體系中，只加入模板基因組1~5種中的任意一種，混合 微球中對應該模板的探針微球就能檢測到相應1種特異信號；當在多重PCR反應體系中加 入模板1~5種的任意2種模板基因組，混合微球中應該能檢測到2種特異信號，該種組合方 式一共有10種；當在多重PCR反應體系中加入模板1~5種的任意3種模板基因組，混合微 球中應該能檢測到3種特異信號，該種組合方式一共有10種；當在多重PCR反應體系中加 入模板1~5種的任意4種模板基因組，混合微球中應該能檢測到4種特異信號，該種組合方 式一共有5種；當在多重PCR反應體系中加入模板1~5種的任意5種模板基因組，混合微球 中應該能檢測到5種特異信號，該種組合方式一共有1種。
[0038] 其中W巧片同時檢測4種菌為例，說明本實驗的可靠性，結果如表6及圖2所示： 表6A組液相巧片檢測任意四種致病菌結果
實施例8 巧片檢測靈敏度實驗 采用建立的多重PCR體系及液相巧片檢測方法進行擴增和檢測。實驗結果表明；糞產(chǎn) 堿桿菌的檢測靈敏度為1pg/ul、蠟樣芽抱桿菌為10fg/ul、豬鏈球菌為100fg/ul、小腸結 腸耶爾森菌為100pg/ul、藤黃微球菌為100fg/ul、馬紅球菌為10fg/ul、奇異變形桿菌 為100pg/ul、黑曲霉為10fg/ul、黃曲霉為100fg/ul、煙曲霉為10pg/ul。巧片檢測靈 敏度極高，fg數(shù)量極的樣本基因組經(jīng)PCR擴增后都能通過液相巧片檢測出來。其中W藤黃 微球菌的實驗結果為例說明，實驗結果如圖3所示。
【主權項】
1. 檢測土壤中10種常見致病菌的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有：SEQ ID NO: 1-30所示的核苷酸。2. -種采用權利要求1所述核苷酸檢測土壤中10種常見致病菌的方法，其特征在于： 包括如下步驟： (1) 借助生物信息學知識和相關生物信息學軟件，對NCBI中能夠檢索到的所有馬紅球 菌、糞產(chǎn)堿桿菌、奇異變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結腸耶爾森菌、豬鏈球菌、藤黃微球菌 的16S rDNA~23S rDNA間區(qū)序列和黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉的18S rDNA~28S rDNA間區(qū)序列 進行同源性分析，找出保守區(qū)域，設計出針對各自基因片段的特異性探針和引物； (2) 采用多重PCR與一步不對稱PCR技術相結合的PCR方法，多重PCR即將十種菌分為 A/B兩組，每組各含五種菌，PCR時，五對引物混合可以同時對五個相應模板進行同時擴增； 一步不對稱PCR即要求PCR擴增中加入的上、下游引物量不同，以致PCR產(chǎn)物大多數(shù)為單鏈 產(chǎn)物，同時保證PCR產(chǎn)物片段大小，以利于同單鏈特異探針進行雜交，提高雜交信號強度； (3) 特異性探針的5'端進行C12和氨基化修飾，與熒光編碼的微球進行偶聯(lián)；將PCR擴 增產(chǎn)物與偶聯(lián)有特異性探針的微球混合液溫育雜交，SA-PE染色，最后用Luminex 100進行 檢測； (4) 由（1)- (3)所建立的液相芯片檢測體系，涉及一種檢測試劑盒的開發(fā)，該檢測試 劑盒包括以上全部步驟。3. 權利要求1所述的檢測土壤中10種常見致病菌的核苷酸在制備識別土壤中的馬紅 球菌、奠產(chǎn)堿桿菌、奇異變形桿菌、賭樣芽孢桿菌、小腸結腸耶爾森菌、豬鏈球菌、藤黃微球 菌、黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測10種常見病原微生物的基因液相芯片及其制備方法。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的方法。本發(fā)明以細菌16S rDNA~23S rDNA、真菌18S rDNA~28S rDNA轉錄間隔區(qū)（ITS）為靶基因，建立了檢測10種土壤常見病原微生物液相芯片和檢測方法，為土壤病原微生物的檢測提供一條可信的途徑。本發(fā)明還提供利用上述基因芯片檢測土壤中常見致病菌的試劑盒。利用本發(fā)明的基因芯片和試劑盒檢測土壤中致病菌，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等諸多優(yōu)點。
【IPC分類】C12Q1/14, C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104988144
【申請?zhí)枴緾N201510365878
【發(fā)明人】王磊, 徐洋洋, 田振陽, 王素微, 曹博陽, 馮露
【申請人】南開大學
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年6月26日