高表達(dá)植酸酶的食藥用真菌菌絲飼料添加劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域和飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，更具體設(shè)及一種高表達(dá)植 酸酶的蛹蟲(chóng)草菌絲飼料添加劑及其制備方法和作為動(dòng)物飼料添加劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磯是畜禽營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中功能最多的營(yíng)養(yǎng)素之一。畜禽必須從飼料中得到充足的磯才 能維持正常生命和生產(chǎn)活動(dòng)，單胃動(dòng)物（豬、雞）飼料中植物性飼料所占比例很大，雖然 飼料中總磯含量較高，但可被單胃動(dòng)物利用的有效磯卻不足。谷物飼料中磯的主要W植酸 和植酸鹽的形式存在，絕大多數(shù)單胃動(dòng)物不能充分消化、利用植酸和植酸鹽中的磯，該不 僅增加了飼養(yǎng)成本，而且，未被動(dòng)物消化吸收的磯還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。此外，植酸鹽能 絡(luò)合某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降低其在動(dòng)物體內(nèi)的消化吸收率，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。動(dòng)物進(jìn)食的磯 只有少部分作為體成分沉積；大部分在參與完體內(nèi)新陳代謝后隨糞便排出體外，因此磯需 不斷供應(yīng)，若飼料中磯含量不足，極易造成磯缺乏。動(dòng)物缺乏巧、磯、維生素D，導(dǎo)致骨骼牙齒 異常、生長(zhǎng)緩慢、生產(chǎn)性能下降、食欲減退和飼料報(bào)酬降低等。
[0003] 因此，就需要在畜禽的飼料中添加一種易于被腸道消化的磯飼料。通常添加無(wú)機(jī) 態(tài)的磯酸氨巧。但是磯酸氨巧是不可再生的礦物資源，并且在市場(chǎng)上的價(jià)格很昂貴，最近的 研究表明，日糧中添加植酸酶可取代磯酸氨巧，可分解植酸和植酸鹽，促進(jìn)飼料中植酸和 植酸鹽的分解，使與磯及磯酸根結(jié)合的內(nèi)源性酶和其他營(yíng)養(yǎng)素得W釋放和利用，減少糞磯 對(duì)環(huán)境的污染，節(jié)省無(wú)機(jī)磯酸鹽的添加。提高植物性飼料中磯的利用率。目前在天然材料 中植酸酶的表達(dá)水平較低，酶學(xué)性能也不能滿(mǎn)足飼料加工的應(yīng)用。采用基因工程手段，構(gòu)建 高表達(dá)植酸酶的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入適宜的系統(tǒng)中表達(dá)生產(chǎn)植酸酶更加適應(yīng)市場(chǎng)需求。
[0004] 蛹蟲(chóng)草，又名北蟲(chóng)草，與冬蟲(chóng)夏草是同一個(gè)屬，但較之冬蟲(chóng)夏草，具有幾個(gè)無(wú)可比 擬的優(yōu)點(diǎn)：一是北蟲(chóng)草為蟲(chóng)草屬的模式種，分布廣泛，為世界各國(guó)學(xué)者所認(rèn)識(shí)和接受。二是 北蟲(chóng)草已在人工條件下育成了完整子座。=是北蟲(chóng)草含有蟲(chóng)草菌素和蟲(chóng)草多糖，其獨(dú)特藥 理作用已日益引起藥學(xué)界的高度重視。由于蛹蟲(chóng)草具有W上優(yōu)點(diǎn)，成為蟲(chóng)草屬中藥用蟲(chóng)草 菌中的侵侵者。冬蟲(chóng)夏草菌是一種生物反應(yīng)器，不管使用什么方法生產(chǎn)，其合成的生物活性 物質(zhì)是一樣的。該些生物活性物質(zhì)的保健和藥用價(jià)值相同。蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸和蟲(chóng)草多糖是 冬蟲(chóng)夏草菌特有的物質(zhì)，是冬蟲(chóng)夏草特殊功效的主要指標(biāo)。而恰恰是該些指標(biāo)，在人工環(huán)境 優(yōu)裕條件下生長(zhǎng)的蛹蟲(chóng)草含量可W比天然條件下生長(zhǎng)得更高。
[0005] 綜上所述，利用轉(zhuǎn)植酸酶基因的蛹蟲(chóng)草作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)飼料添加劑變成為可 能，采用大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)制得高表達(dá)植酸酶的蛹蟲(chóng)草菌絲體，可直接添加于飼料中飼喂動(dòng) 物，不僅能增加動(dòng)物對(duì)磯的利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力，而且具有無(wú)耐藥性、 改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是，為解決飼料磯添加劑價(jià)格昂貴，吸收率低，未被動(dòng)物消化吸收的 磯污染環(huán)境的問(wèn)題，而提供一種可提高動(dòng)物磯的利用率，降低排泄物中磯的存留量的高表 達(dá)植酸酶的食藥用真菌菌絲飼料添加劑。
[0007] 一種表達(dá)載體pCB130NG-phyA，它是； 1) 用值'noin和公CO況雙酶切PCAMBIA1300載體，去除MCS區(qū)，經(jīng)DNA聚合酶Klenow 酶補(bǔ)平后，用T4連接酶連接形成中間載體PCB130-1 ; 2) 在PCB130-1的5^1位點(diǎn)處引入SEQIDNO. 1所示的基因，包含左右邊界序列和多 克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成中間載體PCB130-2 ; 3) PCB130-2分別在A幻酶切位點(diǎn)處引入真菌特異性啟動(dòng)子仿雙在&過(guò)與公CO況酶 切位點(diǎn)之間引入Afos終止子，構(gòu)建成真菌特異性雙T-DNA表達(dá)載體，命名為PCB130NG ; 4) 經(jīng)思酶切，在PCB130NG中插入SEQIDNO. 4所示的基因。
[0008] -種食藥用真菌菌絲體，它轉(zhuǎn)染了 一種表達(dá)載體pCB130NG-phyA; 所述的真菌為蛹蟲(chóng)草，所述的轉(zhuǎn)染，是將PSB130NG-地yA轉(zhuǎn)入蛹蟲(chóng)草原生質(zhì)體，再生獲 得轉(zhuǎn)基因蛹蟲(chóng)草子實(shí)體，W子實(shí)體為母種，培養(yǎng)制得轉(zhuǎn)基因蛹蟲(chóng)草菌絲。
[0009] 高表達(dá)植酸酶的食藥用真菌菌絲飼料添加劑，將一種食藥用真菌菌絲體，用液體 培養(yǎng)基培養(yǎng)，離屯、收集菌絲體，烘干或凍干，粉碎； 所述的真菌為蛹蟲(chóng)草；所述的液體培養(yǎng)基為PDA; 所述的培養(yǎng)時(shí)間為4-8天。
[0010] 本發(fā)明提供了高表達(dá)植酸酶的食藥用真菌菌絲飼料添加劑，通過(guò)構(gòu)建真菌特異性 表達(dá)植酸酶基因的安全表達(dá)載體pCB130NG-phyA，并轉(zhuǎn)入蛹蟲(chóng)草原生質(zhì)體，再生獲得 轉(zhuǎn)基因蛹蟲(chóng)草子實(shí)體后，W子實(shí)體為母種，培養(yǎng)制得轉(zhuǎn)基因蛹蟲(chóng)草菌絲，PDA液體培養(yǎng)基培 養(yǎng)，離屯、收集菌體，烘干粉碎制得高表達(dá)植酸酶的食藥用真菌菌絲飼料添加劑，可直接添加 于飼料中飼喂動(dòng)物，不僅能增加動(dòng)物對(duì)磯的利用率，能大大提高養(yǎng)殖動(dòng)物各期平均日增重 和料肉比，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力，而且具有無(wú)耐藥性、改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)等優(yōu) 點(diǎn)，而且使磯的排泄量降低了 32. 14-56. 14%，從而有利于增加養(yǎng)殖效益，降低對(duì)環(huán)境的污 染，應(yīng)用前景十分誘人。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1真菌特異性雙T-DNA安全表達(dá)載體PCB130NG示意圖； 圖2植酸酶如7^基因的PCR結(jié)果； 圖3pCB130NG-phyA載體酶切鑒定結(jié)果； 圖4轉(zhuǎn)基因蛹蟲(chóng)草菌絲的PCR檢測(cè)； 圖5轉(zhuǎn)基因蛹蟲(chóng)草的PCR檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1.真菌特異性雙T-DNA安全表達(dá)載體的構(gòu)建 利用PCAMBIA1300載體作為基礎(chǔ)載體，首先通過(guò)值?/?淚II和公CO況雙酶切，去除MCS區(qū)， 經(jīng)DNA聚合酶Klenow酶補(bǔ)平后，用T4連接酶連接形成中間載體PCB130-1。接下來(lái)，通過(guò)基 因合成技術(shù)在中間載體的成姑位點(diǎn)處引入一段序列（SEQIDNO. 1)，包含左右邊界序列和 多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成中間載體PCB130-2。在此載體基礎(chǔ)上，通過(guò)PCR技術(shù)及酶切與連接方 法，分別在A幻酶切位點(diǎn)處引入真菌特異性啟動(dòng)子仿W(SEQIDNO. 2)，在&過(guò)與公CO況 酶切位點(diǎn)之間引入Afos終止子（SEQIDNO. 3)，構(gòu)建成真菌特異性雙T-DNA表達(dá)載體，命名 為PCB130NG，該載體示意圖見(jiàn)附圖1。
[0013] 實(shí)施例2.植酸酶基因安全表達(dá)載體構(gòu)建 1. 植酸酶基因的分離及克??；將黑曲霉原始菌種活化進(jìn)行基因組DNA的提取。根據(jù) Genbank登錄植酸酶基因序列（AY513749. 1)，利用軟件設(shè)計(jì)克隆植酸酶基因的上下游 引物，引物兩端均含有思酶切位點(diǎn)，W黑曲霉基因組DNA為模板克隆植酸酶基因大 小約為1524bp(SEQIDNO. 4)，見(jiàn)附圖2。其表達(dá)氨基酸序列為SEQIDNO. 5。
[0014]h游引物：5'TCTAGAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTAC3'（思al) 下游引物；5'TCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCA3'（思) 2. 植酸酶基因安全表達(dá)載體構(gòu)建；真菌表達(dá)載體PCB130NG經(jīng)思al酶切，與同樣經(jīng) 思酶切后的植酸酶基因PCR產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化和測(cè)序鑒定后，證實(shí)真菌安 全表達(dá)載體pCB130NG-phyA構(gòu)建成功（見(jiàn)附圖3)，W利于在真菌有性世代篩選出只含目的 基因而不含選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因后代。
[0015] 實(shí)施例3.轉(zhuǎn)植酸酶基因蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的獲得 1.蛹蟲(chóng)草原生質(zhì)體的提取與轉(zhuǎn)化； (1)蛹蟲(chóng)草菌絲體的培養(yǎng)：將蛹蟲(chóng)草菌絲體于優(yōu)化的固體PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)9天，然后再 接種于150血液體PDA培養(yǎng)基，26-28°C、100-130r/min，250血搖瓶振蕩暗培養(yǎng)4天，直至長(zhǎng) 成生長(zhǎng)量較多、大小均勻、狀態(tài)良好的菌絲球。
[0016] (2)原生質(zhì)體的制備：用0. 6mol/L的甘露醇配制混合酶液，即溶壁酶和蝸牛酶復(fù) 合添加，總量為3. 0-4. 0%，比例為1:1 ;按照菌絲體重量；酶液=1:6-10的比例酶解菌絲，酶 解溫度為34°C，酶解時(shí)間2. 5-4小時(shí)；W無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾除去殘余蛹蟲(chóng)草菌絲體，5000g離 屯、lOmin，收集原生質(zhì)體。
[0017] (3)蛹蟲(chóng)草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：將原生質(zhì)體濃度調(diào)節(jié)到1-5X1Q7個(gè)/ml,載體質(zhì)粒的添 加量為25-30嗦，混合均勻后，置于冰上5-lOmin后，加入30W陽(yáng)G緩沖液（25%陽(yáng)G4000， 50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris-肥l，pH7. 5)，冰浴 15-20min，再加