番茄HsfA1a基因在提高植物自噬體活性及抗旱性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)一種番茄化fAla基因在提高植物自瞻體活性 及抗旱性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 進(jìn)入21世紀(jì)W來，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展已經(jīng)成為世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的主流。設(shè)施農(nóng)業(yè)作為現(xiàn) 代農(nóng)業(yè)主要形式，已經(jīng)成為各國農(nóng)業(yè)發(fā)展重點。據(jù)統(tǒng)計，2011年中國蔬菜產(chǎn)值達(dá)到1. 26萬 億元，首次超過糧食總產(chǎn)值，成為中國產(chǎn)值最大的農(nóng)產(chǎn)品。我國設(shè)施農(nóng)業(yè)的總體發(fā)展水平還 不高，設(shè)施結(jié)構(gòu)簡單，資金投入不足，設(shè)施裝備落后，抵御自然災(zāi)害的能力差，近年來，全球 氣候惡化，二氧化碳升高，全球氣候變暖，干旱等自然災(zāi)害頻繁發(fā)生，對農(nóng)業(yè)的產(chǎn)量及品質(zhì) 造成了極大的威脅。
[000引 番茄（SolanumlycopersicumL.)是茄科（Solanaceae)茄屬中的一年生或多年 生草本植物，別名西紅柿、洋柿子，是世界范圍內(nèi)栽培最廣、消費量最大的蔬菜作物。番茄品 種類型豐富，既可鮮食作蔬菜又可作水果，番茄中的番茄紅素成分可預(yù)防各種癌癥，是世界 上最流行的健康食品之一。番茄在設(shè)施蔬菜中占有重要地位，因此提高番茄應(yīng)對不良環(huán)境 的能力，培育抗性品種具有重要的實際生產(chǎn)意義。
[0004] 熱激轉(zhuǎn)錄因子化eatstresstranscriptionfactor,Hsf)廣泛存在于動植物 體內(nèi)，是植物應(yīng)答高溫等逆境脅迫的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，能夠識別特定的熱激元件化eat stresselements,服Es)，主要調(diào)節(jié)熱激蛋白化eatshockproteins，Hsps)的表達(dá)，在蛋白 質(zhì)的折疊、分布及降解中熱激蛋白作為重要的分子伴侶發(fā)揮重要的作用。當(dāng)植物細(xì)胞受到 如高溫、低溫、干旱、機械傷等逆境后，Hsf會被磯酸化激活，轉(zhuǎn)至細(xì)胞核與下游逆境響應(yīng)基 因啟動子上的服E特異性結(jié)合，加速該些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而增強植物對逆境脅迫的抗 性。植物Hsf是一個復(fù)雜的基因家族，在擬南芥中有21個，水稻中有25個，番茄有24個。 根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)將其分為A、B和CS類。
[0005] 目前對化f的研究主要集中在其對逆境脅迫的響應(yīng)及對下游熱激蛋白的調(diào)控上。 擬南芥的A地sfAla、A地sfA化能被高溫誘導(dǎo)，而A地sfA2基因缺失后，使植株的耐熱性顯著 下降，關(guān)于番茄的化f的研究主要集中在A族及其在高溫脅迫中的作用。番茄化fAla在高 溫脅迫中是主要的調(diào)節(jié)因子，在熱脅迫下，化fAla、化fA2和化巧1會結(jié)合形成=聚體誘導(dǎo) Hsp70和化p90等化P的表達(dá)，化fAlaRNAi植株在熱激后化fA2和化巧1的表達(dá)顯著降 低，因此抗熱性減弱。番茄化fAla在高溫W外的其它脅迫中的作用尚未報道，因此深入研 究化fAla的功能，對研發(fā)抗性品種具有一定的理論指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種番茄化fAla基因在提高植物自瞻體活性及抗旱性中的應(yīng)用，研 究番茄化fAla在高溫W外的其它脅迫中的應(yīng)用。
[0007] 番茄化fAla基因在提高植物自瞻體活性及抗旱性中的應(yīng)用。包括如下步驟：
[000引 （1)構(gòu)建含番茄化fAla基因過表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌A和含番茄化fAla 基因沉默載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌B;
[0009] (2)將所述根癌農(nóng)桿菌工程菌A介導(dǎo)轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物外植體，制備得到化fAla基因 轉(zhuǎn)基因植株；將所述根癌農(nóng)桿菌工程菌B浸染目標(biāo)植物子葉，制備得到化fAla基因沉默植 株；
[0010] (3)將所述化fAla基因轉(zhuǎn)基因植株和化fAla基因沉默植株進(jìn)行干旱脅迫處理，觀 察植株自瞻體的數(shù)目和抗旱表型。
[ocm] 本發(fā)明的應(yīng)用是指堿基序列如SEQ TD NO ;1所示的化fAla基因編碼的蛋白在調(diào) 控植物自瞻體活性和干旱抗性中的至少一種應(yīng)用。具體表現(xiàn)為自瞻體數(shù)目增加或減少W及 干旱抗性增強或降低。
[0012] 化fAla基因在植物中的表達(dá)量越低，在干旱脅迫下所述植物葉片內(nèi)自瞻體的數(shù)目 越少，對干旱越敏感；HsfAla基因在所述植物中的表達(dá)量越高，在干旱脅迫下所述植物葉 片內(nèi)自瞻體的數(shù)目越多，增強干旱的抗性。
[001引本發(fā)明所提供的培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可分為如下（A)或炬）；
[0014] (A)培育具有自瞻體數(shù)目增加和/或植株抗旱性增強目的性狀的轉(zhuǎn)基因植物，包 括如下步驟：
[0015] a)向目標(biāo)植物中導(dǎo)入堿基序列如SEQ TD NO ;1所示化fAla基因進(jìn)行過表達(dá)，得 到化fAla基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株；
[0016]b)將化fAla基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株與未處理的目標(biāo)植物相比，得到具有自瞻 體數(shù)目增加和/或植株抗旱性增強目的性狀的轉(zhuǎn)基因植物。
[0017] 做培育具有自瞻體數(shù)目減少和/或植株抗旱性減弱目的性狀的轉(zhuǎn)基因植物，包 括如下步驟：
[0018] a)向目標(biāo)植物中導(dǎo)入堿基序列如SEQ TD NO ;1所示化fAla基因進(jìn)行抑制表達(dá)， 得到化fAla基因沉默轉(zhuǎn)基因植株；
[0019]b)將化fAla基因沉默轉(zhuǎn)基因植株與未處理的目標(biāo)植物相比，得到具有自瞻體數(shù) 目減少和/或植株抗旱性減弱目的性狀的轉(zhuǎn)基因植物。
[0020] 在上述方法（A)中，HsfAla基因可通過含有所述基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植 物中，重組表達(dá)載體可用已有的pFG巧941、PCAMBIA1300和地1121等或其它衍生植物表達(dá) 載體，使用植物表達(dá)載體構(gòu)建重組載體時，可W使用組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子。
[0021] 在上述方法炬）中，在目的植物中對，HsfAla基因進(jìn)行抑制表達(dá)，可為任何可降低 目的植物中所述化fAla基因的表達(dá)的方法。在本發(fā)明中，在目的植物中對化fAla基因進(jìn) 行抑制表達(dá)是通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默的方式實現(xiàn)的。
[0022] 所述番茄化fAla基因選自W下兩種中任意一種：
[002引 a、所述番茄化fAla基因的堿基序列如SEQTDNO;1所示；
[0024]b、任一其堿基序列與SEQTDNO;1所示序列有90%W上同源性且編碼如SEQTD NO;2所示氨基酸序列的DNA分子。
[0025] 所述根癌農(nóng)桿菌工程菌A和根癌農(nóng)桿菌工程菌B的制備方法如下：
[0026] (a)從番茄幼嫩葉片中提取總RNA;
[0027] (b)將步驟（a)中獲得的番茄總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;
[002引（C)W步驟化）獲得的cDNA為模板，SlHsfAlaOEF(SEQ TD NO ;3)和S化sfAlaOER(SEQ TD N0;4)為引物（含AscI和化nl限制性酶切位點）對化fAla基因進(jìn) 行擴增，連接到PFGC1008-HA載體得0E載體；S化sfAlaF(SEQ TD N0;5)和SlHsfAlaR(SEQ TD NO ;6)為引物（含甜al和BamHI限制性酶切位點）對化fAla基因進(jìn)行擴增，連接到 PTRV2載體得VIGS載體；
[0029] (d)將步驟（C)獲得的0E載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含化fAla基因植 物過表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌A ;將步驟（C)獲得的VIGS載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101 中，獲得含化fAla基因沉默載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌B。
[0030]從番茄幼嫩葉片中提取總RNA采用Tiangen Plant total RNA extraction kit, 其步驟為：
[0031] (1)取0.Ig葉片在液氮中磨碎，加1血裂解液，禍旋混勻；
[0032] (2)將均漿樣品在15-30°C放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
[0033] (3)4°C，12, 000巧m離屯、5min，棄上清，轉(zhuǎn)入一個新的無RNase的離屯、管中。
[0034] (4)加入200化氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，室溫放置3min ;
[0035] 巧)4°C，12, 00化pm離屯、lOmin，樣品會分為S層；黃色的有機相，中間層和無色的 水相，RNA主要在水相中，水相的體積約為所用裂解液RZ試劑的50%。把水相轉(zhuǎn)移到新管 中，進(jìn)行下一步操作；
[0036] (6)緩慢加入0.5倍體積的無水己醇，混合均勻（此時肯能會出現(xiàn)沉淀）。將得到 的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3,4°C，12, 00化pm離屯、30s，棄掉收集管中的廢液；
[0037] (7)向吸附柱CR3中加入500化去蛋白液畑，4°C，12, 000巧m離屯、30s，棄廢液；
[003引 做向吸附柱CR3中加入600yL漂洗液RW，室溫靜止2min，4°C，12, 000巧m離屯、 30s，棄廢液；
[0039] (9)重復(fù)操作步驟做；
[0040] (10)將吸附柱放入2血收集管中，4°C，12, 00化pm離屯、2min，去除殘余廢液；
[0041] (11)將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個新的離屯、管中，加入50yLRNase-Free (1地2〇,室溫 放置 2min，4°C，12, 000巧m離屯、2min;
[0042](。）用紫外分光光度計測定0〇26。/〇〇28。檢驗RNA樣品含量與純度，并用瓊脂糖凝 膠電泳對RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢驗。
[004引將番茄總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA采用Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit。
[0044] 所用引物序列如下：
[0045] SlHsfAla犯F ;5< -TTGGCGCGCCATGGAGCCGAATTCTTAT-3f (沈Q TD NO ;3)，
[0046] SlHsfAla犯R的序列為；5'-GGGGTACCGATCATATGTTTTTGTTG-3'(沈Q TD NO ;4)，
[0047] SlHsfAlaF ;5' -GCTCTAGACATCTCAGTCATCATCTC-3'(沈Q TD NO ;5)，
[0048] SlHsfAlaR;5'-CGCGGATCCGCGCCGTCTGCAACATTG-3'(沈Q TD NO ;6)。
[0049] 本發(fā)明中自瞻體數(shù)目的觀察方法如下：
[0050] 采用單丹橫酷尸胺（monodansylcadaverine，MDC)染色和透射電鏡 (transmission electron microscopy，TEM)。
[CK)5U MDC染色，具體方法為；
[0化引a)將番茄葉片剪成2111111>&