一種提高杜仲含膠量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及了一種提高杜仲含膠量的方法，具體設(shè)及通過特定基因?qū)攵岣叨?仲含膠量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 杜仲巧ucommiaulmoidesOliv.)是我國特有的名貴藥用樹種，且樹皮、根、莖、 葉、花和果實中等各組織中均含有大量的白色絲狀物質(zhì)-杜仲橡膠巧ucommiaulmoides RiAber，抓時，因此杜仲被譽為優(yōu)質(zhì)的天然橡膠樹種。橡膠是我國重要的戰(zhàn)略物質(zhì)資源，橡 膠工業(yè)是我國國民經(jīng)濟最重要的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)之一。=葉橡膠在我國適生區(qū)域很窄，產(chǎn)能已達 極限。國內(nèi)天然橡膠需求量遠遠超過國內(nèi)產(chǎn)量，天然橡膠資源的匿乏制約我國橡膠產(chǎn)業(yè)的 發(fā)展，因此開發(fā)第二天然橡膠資源迫在眉睫。杜仲橡膠是杜仲次生代謝途徑產(chǎn)生的祗類高 分子化合物，與=葉橡膠不同，杜仲橡膠的結(jié)構(gòu)是反式聚異戊二締，獨有"橡膠-塑料二重 性"，其低溫可塑性、熱彈性、共混性、高絕緣性和耐腐蝕性方面遠遠超過了 =葉橡膠，用杜 仲橡膠改性的橡膠組合物，具有耐磨、耐腐蝕、節(jié)能等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于橡膠工業(yè)、航空航 天、軍工、船舶、化工、醫(yī)療等多個領(lǐng)域。但由于杜仲葉片含膠量低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下， 成為杜仲橡膠產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。
[0003] 提高杜仲橡膠產(chǎn)量的最根本的途徑就是揭示杜仲橡膠的生物合成過程中的基 因調(diào)控機理。杜仲橡膠作為一種高分子量反式聚異戊二締，是在一種特殊的異戊締基轉(zhuǎn) 移酶作用下將低分子量反式異戊二締不斷縮合而形成的，而低分子量異戊二締的生物 合成是通過異戊締基焦磯酸（IP巧和二甲基丙締基焦磯酸值MAP巧的不斷縮合而形成 (Nishibe-S.Bioactivelignansandflavonoidsfromtraditionalmedicines[J]. PolyphenolstheInternationalConference, 1995, 113-122.)。目前，已經(jīng)鑒定出若 干個參與反式橡膠生物合成的基因，如重要的橡膠蛋白編碼基因（MLP)、橡膠延伸因子 (RFF)、橡膠顆粒膜蛋白（RPMP)、小型橡膠顆粒蛋白（SRP巧、反式異戊締基焦磯酸合酶基 因（TIDS)等（MichelRohmer.Thediscoveryofamevalonate-independentpathway forisoprenoidbiosynthesisinbacteria,algaeandhigherplants[J].Nat.Prod. Rep, 1999, 16:565-574.LytleBL等，StructuresoftwoArabidopsisthalianamajor latexproteinsrepresentnovelhelixgripfolds[J].Proteins, 2009, 76:237-243. NesslerCL等，Organizationofthemajorlatexproteingenefamilyinopium po卵y[J].PlantMolBiol, 1992, 20:749-752.NobuakiSuzuki等，Constructionand analysisofESTlibrariesofthetranspolyisopreneproducingplant,Eucommia ulmoidesOliver.Planta[J]. 2012,DOIIO. 1007/s00425-012-1679-x.)。雖然對杜仲橡膠 合成相關(guān)基因進行了克隆和基因轉(zhuǎn)化，但尚未揭示相關(guān)基因的應(yīng)用方法。本發(fā)明篩選出了 杜仲橡膠合成的關(guān)鍵酶基因，并設(shè)計了轉(zhuǎn)基因的浸染方法，從遺傳水平上大幅度提高杜仲 橡膠含量。該方法簡單易行，提高了新生周皮的含膠量，對降低杜仲橡膠生產(chǎn)成本，促進杜 仲橡膠產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，滿足我國橡膠產(chǎn)業(yè)的需求具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了在一定程度上解決上述問題，本發(fā)明的目的在于利用基因表達規(guī)律和杜仲橡 膠合成規(guī)律，提出了一種杜仲橡膠關(guān)鍵酶基因，并通過遺傳轉(zhuǎn)化浸染方法將該基因轉(zhuǎn)化至 杜仲中，獲得轉(zhuǎn)基因植株并通過生物學(xué)功能驗證，表明本發(fā)明克隆的化TIDS5基因顯著增 加杜仲的含膠量，即本發(fā)明提供了一種提高杜仲含膠量的方法。
[0005] 為了實現(xiàn)W上目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0006] 根據(jù)植物基因克隆技術(shù)克隆化TIDS5基因，利用Real-TimePCR檢測該基因在不 同時期不同組織的表達，利用索氏提取方法提取杜仲橡膠，分析杜仲橡膠合成規(guī)律，從而確 定杜仲橡膠合成的關(guān)鍵酶基因為化TIDS5。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化杜仲，并將獲得的 轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)生物學(xué)功能驗證，表明本發(fā)明克隆的化TIDS5基因具有調(diào)控杜仲橡膠合成的 功能。本發(fā)明的實施案例部分，將詳細描述橡膠合成的關(guān)鍵酶基因EUTIDS5基因的分離克 隆，表達規(guī)律W及功能驗證的方法。
[0007]EUTIDS5基因可W來源于我國常見的杜仲品種，例如可W為下表所列的品種：
[000引
[0009] 本發(fā)明一方面是提供了一種提高杜仲含膠量的方法，包括W下步驟：
[0010] 1)將杜仲樹皮初皮部剝皮成多個格子，成間隔隔狀露出表面的形成層；
[0011] 2)進行浸染操作；將挑取含有化TIDS5重組表達載體的農(nóng)桿菌單菌落培養(yǎng)的菌 液，侵染杜仲剝皮的表面形成層；
[0012] 3)剝皮侵染后用塑料膜包裹剝面，保濕防曬生長。
[0013] 進一步地，所述的格子的單格面積為2-lOcm2,更優(yōu)選為3-6cm2,所述格子可W為 各種形狀，作為一個優(yōu)選的實施例為2cmX2cm方格。
[0014] 進一步地，步驟2)所述的菌液的ODe。。值為0. 5~0. 9。
[0015] 進一步地，步驟3)塑料膜包裹剝面時間為20~100天，例如可W為20天、40天、 或50天、或60天、或70天、或80天、或90天、或100天，更優(yōu)選為30~90天，進一步優(yōu)選 為40~80天。
[0016] 進一步地，步驟2)的浸染操作進行2-5次，每次間隔2-4天，優(yōu)選浸染操作進行3 次，每次間隔3天。
[0017] 進一步地，所述含有重組表達載體的農(nóng)桿菌單菌落是通過如下方法獲得；將含有 EuTIDS5的質(zhì)粒加入帶根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101感受態(tài)細胞中，輕柔混合后加入到預(yù)冷電 擊轉(zhuǎn)化杯中進行電擊轉(zhuǎn)化；電擊轉(zhuǎn)化后，將帶有質(zhì)粒的感受態(tài)細胞質(zhì)加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)；取 液，均勻涂在含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)；挑取單菌落搖菌，搖菌至生長對 數(shù)期。一個優(yōu)選的實施例為：將1yL含有化TIDS5的質(zhì)粒加入帶根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101 感受態(tài)細胞中，輕柔混合后加入到預(yù)冷電擊轉(zhuǎn)化杯中進行電擊轉(zhuǎn)化；電擊轉(zhuǎn)化后，將帶有質(zhì) 粒的感受態(tài)細胞質(zhì)加入200yL液體培養(yǎng)基，28°C，ISOrpm，培養(yǎng)化；取100yL菌液均勻， 均勻涂布到含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)4她；挑取單菌落搖菌，28°C， 180巧m，搖菌2化至生長對數(shù)期。
[001引進一步地，所述含有化TIDS5的質(zhì)粒的制備方法是：通過PCR的方法擴增 化TIDS5,連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后提取得到含有化TIDS5的質(zhì)粒。一個優(yōu)選的實施例為；通過 PCR的方法進行克隆，所述克隆的PCR體系見下表：
[0019]
[0020] PCR克隆反應(yīng)條件為；98°C預(yù)變性Imin;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延伸 2min，8 個循環(huán)；98°C變性 10s，68°C延伸 2min，32 個循環(huán)；68°C延伸lOmin;
[0021] 連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，并提取質(zhì)粒。
[002引 進一步地，EUTIDS5的編碼序列如SEQIDN0:2所示。
[002引進一步地，PCR擴增化TIDS5的上游引物巧' -3'）和下游引物巧' -3'）分別如SEQ IDN0:3和4所示。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點為；能夠顯著提高杜仲含膠量。
【附圖說明】
[0025] 圖1;不同時期杜仲葉片和果實含膠量。
[0026] 圖2 ;杜仲葉片和果實在不同時期化TIDS5的表達量。
[0027] 圖3;不同時期杜仲葉片中化TIDS5相對表達量和含膠增長速率的規(guī)律。
[002引圖4 ;不同時期杜仲果實中化TIDS5相對表達量和含膠增長速率的規(guī)律。
[0029] 圖5 ;轉(zhuǎn)基因煙草植株P(guān)CR檢測電泳圖。
[0030] 圖6 ;轉(zhuǎn)基因煙草不同株系35s: :EuTIDS5的相對表達量。
[0031] 圖7;杜仲樹皮的轉(zhuǎn)化。
[0032] 圖8;轉(zhuǎn)基因樹皮表型分析。
【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行描述，W便本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的 理解本發(fā)明，并在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可W對本發(fā)明做出各種改變和修改， W使其使用不同的用途和條