一種利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化，具體設(shè)及一種利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的 遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是世界=大糧食作物之一，也是現(xiàn)代食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和化學工業(yè)的重要 原料，它的遺傳轉(zhuǎn)化研究一直受到各國科學家的重視。現(xiàn)今主要采用的方法是W玉米幼胚 為受體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，但是玉米為單子葉植物，不是農(nóng)桿菌的天然宿主，因此農(nóng)桿菌介導 玉米轉(zhuǎn)化難度較大。
[0003] 經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，公開號為CN103114106的發(fā)明專利申請公開了一種農(nóng)桿菌侵染玉米 幼胚的方法，在侵染過程中對玉米幼胚先進行熱激處理，再進行農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)，該樣 可W大大提高農(nóng)桿菌的侵染效率。
[0004][0005] 但是現(xiàn)有的遺傳轉(zhuǎn)化方法不能保證轉(zhuǎn)化效率，且有農(nóng)桿菌侵染過度導致的染菌問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定、簡單易行的利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的 遺傳轉(zhuǎn)化方法。
[0007] 為達到上述目的，具體采用如下的技術(shù)方案：
[000引一種利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體包括如下步驟：
[0009] (1)制備農(nóng)桿菌侵染液；取農(nóng)桿菌菌斑溶于抑值為4. 8~5. 6的侵染液中，室溫 (19~25°C)慢搖3~化，調(diào)0〇55。為0. 5~0. 55,得農(nóng)桿菌侵染液；
[0010] (2)侵染與共培養(yǎng)：用所述侵染液對玉米幼胚侵染，侵染液：玉米幼胚=ImL: (100~150)個，侵染結(jié)束后去除侵染液，加入所述農(nóng)桿菌侵染液，避光5~15min，侵染結(jié) 束后，將幼胚盾面朝上，放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，19~23°C暗培養(yǎng)1~4天。
[0011] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，侵染液的組分如下；N6培養(yǎng)基1. 99~3. 98g/L，2, 4-二 氯苯氧己酸1. 0~1. 5mg/l，脯氨酸0. 5~0. 7g/l，庶糖68. 4~75g/l，葡萄糖36~40g/ L2-嗎咐己橫酸0. 3~0. 5g/l，己酷了香酬100~150mM/L。
[0012] 優(yōu)選地，侵染液的組分如下；N6培養(yǎng)基1. 99g/l，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/l，脯氨 酸0. 7g/l，庶糖68. 4g/l，葡萄糖36g/l，2-嗎咐己橫酸0. 5g/l，己酷了香酬lOOmM/L。
[0013] 最優(yōu)選地，當侵染液的抑值為5. 2時，能夠有效促進農(nóng)桿菌活性，提高侵染效率。
[0014] 更加具體的，侵染液的制備方法為：將N6培養(yǎng)基、2, 4-二氯苯氧己酸、脯氨酸、庶 糖、葡萄糖和2-嗎咐己橫酸加入蒸饋水中徹底溶解，調(diào)節(jié)抑值后，冷卻至50°C，加入抽濾滅 菌保存的己酷了香酬，之后攬拌均勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中，40-50皿/L。本發(fā)明提供的侵染 液的制備方法能夠最大程度的保持各組分的活性，有利于提高侵染效率。
[0015] 在本發(fā)明的步驟（2)中，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下N6培養(yǎng)基1. 99~3. 98g/ L，2, 4-二氯苯氧己酸1. 0~1. 5mg/L，脯氨酸0. 5~0. 7g/l，庶糖30~35g/L，2-嗎咐己橫 酸0. 3~0. 5g/l，植物凝膠3~4g/l，己酷了香酬100~150mM/L，硝酸銀5~7mM/L，半脫 氨酸鹽酸鹽300~400mg/L，抑值為5. 8~6. 0。
[0016] 優(yōu)選地，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下；N6培養(yǎng)基1.99g/l，2,4-二氯苯氧己酸 1. 5mg/l，脯氨酸0. 7g/l，庶糖30g/l，2-嗎咐己橫酸0. 5g/l，植物凝膠3g/l，己酷了香酬 lOOmM/L，硝酸銀5mM/L，半脫氨酸鹽酸鹽400mg/L，抑值為5. 8。當W此作為共培養(yǎng)培養(yǎng)基 時，可防止在共培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌過快繁殖，侵染過度，造成幼胚死亡。
[0017] 更加具體的，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法為：將N6培養(yǎng)基、2, 4-二氯苯氧己酸、脯 氨酸、庶糖、2-嗎咐己橫酸混合，定容至抑5. 8~6. 0后加入植物凝膠，然后高溫高壓滅菌 (優(yōu)選為121°C高溫高壓滅菌30min)，最后冷卻至50-45°C加入抽濾滅菌的己酷了香酬、硝 酸銀、半脫氨酸鹽酸鹽，在磁力攬拌器上攬拌均勻，分裝到無菌培養(yǎng)皿中即得。本發(fā)明提供 的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法保證了培養(yǎng)基各組分的活性不會喪失，濃度精確，無菌安全。 [001引在本發(fā)明的技術(shù)方案中，當侵染結(jié)束后，優(yōu)選將幼胚盾面朝上，放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基 中，19~23°C暗培養(yǎng)1~3天，更加優(yōu)選在22°C培養(yǎng)3天，此時可W顯著提高玉米幼胚的轉(zhuǎn) 化率。
[0019] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，農(nóng)桿菌菌斑的制備方法可為現(xiàn)有技術(shù)中的任意方法，優(yōu) 選采用如下的方法；用接種環(huán)挑取農(nóng)桿菌菌株在農(nóng)桿菌固體培養(yǎng)基畫線，25~30°C暗培養(yǎng) 2~3天（優(yōu)選為28°C暗培養(yǎng)2天），將農(nóng)桿菌固體培養(yǎng)基保存在-80°C的環(huán)境中，每次挑 取一個菌斑涂于農(nóng)桿菌培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中，20~25°C暗培養(yǎng)2~4天（優(yōu)選為22°C暗培 養(yǎng)3天）后即可得到農(nóng)桿菌菌斑。
[0020] 其中，采用的農(nóng)桿菌菌株為EHA101含質(zhì)粒PTF102,含bar基因、0-葡萄糖巧酸 酶報告基因，獲取自吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全研究課題 組。
[0021] 所述農(nóng)桿菌固體培養(yǎng)基的組分如下；蛋白腺lOg/L化C1 15g/l，酵母提取物lOg/ L，瓊脂15g/L，利福平50mg/l，壯觀霉素50mg/l，卡那霉素50mg/L。酵母提取物可選有市售 產(chǎn)品，例如sigma公司的Y1625。
[0022] 更加具體的，農(nóng)桿菌固體培養(yǎng)基的制備方法為：將蛋白腺、化C1、酵母提取物、瓊脂 混合，調(diào)節(jié)抑值（優(yōu)選為抑值為7. 0)，12rc高溫高壓滅菌后冷卻至50°CW下加入利福平、 壯觀霉素、卡那霉素50mg/L。本發(fā)明提供的農(nóng)桿菌固體培養(yǎng)基的制備方法保證菌體能夠正 常生長，抗生素的加入對菌體進行有效的篩選，保證了后續(xù)轉(zhuǎn)化試驗的效率
[0023] 本發(fā)明所述玉米幼胚的剝?nèi)》椒?；選取自花授粉9~11天的幼穗，滅菌，在幼穗 的窄端將綴子尖端插入幼穗中，使用手術(shù)刀片從窄端到寬端削掉幼粒1/3~2/3,用刀背在 幼粒的寬端進刀，向窄端用力挑取幼胚。
[0024] 本發(fā)明利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法的最佳實施方式能使玉米幼胚 的轉(zhuǎn)化率達到48. 6%，具體包括如下步驟；
[0025] (1)制備農(nóng)桿菌侵染液；取農(nóng)桿菌菌斑溶于侵染液中，室溫慢搖3~化，調(diào)0〇55。= 0. 5~0. 55,所述侵染液的抑值為5. 2;
[0026] (2)侵染與共培養(yǎng)；用所述侵染液對玉米幼胚進行侵染，侵染液：玉米幼胚=ImL: (100~150)個，侵染結(jié)束后去除侵染液，加入所述農(nóng)桿菌侵染液，避光lOmin侵染，侵染結(jié) 束后，將幼胚盾面朝上，放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，22°C暗培養(yǎng)3天；
[0027] 其中，所述侵染液的組分如下；N6培養(yǎng)基1. 99g/L，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/L，脯 氨酸0. 7g/l，庶糖68. 4g/l，葡萄糖36g/l，2-嗎咐己橫酸0. 5g/l，己酷了香酬lOOmM/1，pH 值為5. 2;
[002引所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下；N6培養(yǎng)基1. 99g/l，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/l， 脯氨酸0. 7g/l，庶糖30g/l，2-嗎咐己橫酸0. 5g/l，植物凝膠3g/l，己酷了香酬lOOmM/1，硝 酸銀5mM/L，半脫氨酸鹽酸鹽400mg/L，抑值為5. 8。
[0029] 本發(fā)明提供的利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法，明確了侵染液、共培養(yǎng) 培養(yǎng)基的配方及抑值，農(nóng)桿菌菌液的制備方法及共培養(yǎng)的時間，其培養(yǎng)方法簡便、體系成 熟，轉(zhuǎn)化結(jié)果準確穩(wěn)定高效。
【具體實施方式】
[0030]W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的原料 均可選用市售的產(chǎn)品。
[0031] 實施例1
[0032] 在本實施例中玉米幼胚取自玉米自交系化II幼穗，化II幼穗由吉林省農(nóng)業(yè)科學 院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全研究課題組提供，農(nóng)桿菌菌株EHA101含質(zhì)粒 PTF102,含bar基因、0-葡萄糖巧酸酶報告基因。
[0033] 其中，玉米幼胚的制備方法為；選取自花授粉9~11天的幼穗，剝?nèi)∮姿氲南锶~， 將7-8個幼穗放入滅菌的量杯中，加入75% (體積比）酒精，用綴子攬拌，去除附著在幼穗 上的氣泡，滅菌10分鐘，倒出酒精。用無菌綴子夾幼穗入鋼盤中，在幼穗的窄端將綴子尖端 插入幼穗中，使用手術(shù)刀片從窄端到寬端削掉幼粒1/3~2/3,用刀背在幼粒的寬端進刀， 向窄端用力挑取幼胚。
[0034] 本實施例利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括W下步驟：
[0035] (1)制備農(nóng)桿菌侵染液；將農(nóng)桿菌甘油管從-80°C冰箱中取出，接種環(huán)調(diào)菌在農(nóng)桿 菌培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基畫線，28°C，暗培養(yǎng)2天，將培養(yǎng)基存于4°C冰箱，每次挑取一個菌斑涂 于農(nóng)桿菌培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中，19°C，暗培養(yǎng)3天。刮一個直徑3mm的菌斑溶于5mL的侵染 培養(yǎng)基中，室溫慢搖3~4小時，調(diào)0〇55。= 0. 5