一種簸箕柳抗性苗的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體地說設及一種鑛貸柳抗性苗的制備方法。
【背景技術】
[0002] 鑛貸柳（SalixsuchowensisQieng)，楊柳科（Salicaceae)柳屬（Salix)，落葉叢 生多年生灌木植物，枝條呈黃綠色或略帶紫色，葉互生，披針形，長度超過10cm，無毛?；ㄏ?葉開放，花期為3月，果期在4-5月。產地主要分布在淮河流域，浙江、江蘇、山東、河南等地 也有栽培。鑛貸柳個體小，世代周期短，一般一年即可開花，自然變異豐富。該些特點使得 鑛貸柳更適合于開展大規(guī)模田間試驗，是進行林木遺傳研究的理想材料。
[0003] 遺傳轉化技術是研究基因功能的重要手段，然而到目前為止，人們對木本植物基 因功能的相關研究還很有限，關于柳樹的遺傳轉化研究還停留在再生體系的初步探索階 段，并未獲得突破性的研究成果。因此，研究鑛貸柳組培再生體系，并建立穩(wěn)定的遺傳轉化 系統(tǒng)，對于今后大規(guī)模開展鑛貸柳乃至楊柳科植物的遺傳轉化研究，推動林木功能基因組 研究具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 發(fā)明目的；針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種鑛貸柳抗性苗 的制備方法，為林木植物基因功能研究和遺傳改良提供一個新途徑。
[000引技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0006] 一種鑛貸柳抗性苗的制備方法，包括W下步驟：
[0007] 1)將鑛貸柳組培苗置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖；
[000引 2)選取繼代的組培苗莖，剪成l-2cm長的莖段，剪去周圍的葉片，作為外植體接種 于分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)2-3d;分化培養(yǎng)基為WP培養(yǎng)基，附加細胞分裂素6-BA0. 1-1.Omg/L細胞分裂素TDZ0. 005mg/l，生長素IBA0. 01-0. 005mg/l，庶糖 30g/l，水晶洋菜 2g/L;
[0009] 3)挑取農桿菌的菌落接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后，取部 分轉接至LB液體培養(yǎng)基中，待菌體進入指數(shù)生長期，通過離屯、得到菌體，取WP液體養(yǎng)基培 養(yǎng)基懸浮菌體，獲得侵染菌液.
[0010] 4)將步驟。的預培養(yǎng)后的莖段浸入步驟如的侵染菌液，振蕩，浸泡10-20min后， 除去多余菌液，放回分化培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)；
[0011] 5)對共培養(yǎng)后的莖段洗漆除去農桿菌，轉移到分化篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，定期更換 分化篩選培養(yǎng)基，直至分化出可見卡那霉素抗性芽；
[0012] 6)將卡那霉素抗性芽連轉移到不定芽伸長篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)；
[0013] 7)待抗性芽伸長至l-2cm，將每個抗性芽分離獨立，移入生根篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 經過一段時間的繼代培養(yǎng)即可得到完整的抗性苗。
[0014] 步驟1)中，所述的基本培養(yǎng)基為1/2WP，附加庶糖25-30g/l，水晶洋菜2g/L，pH 5. 8,121 ± 1°C，滅菌 18min。
[0015] 步驟2)中，所述的預培養(yǎng)條件為，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照3000-40001UX，光照時 間1化/d。
[0016] 步驟2)中，所述分化培養(yǎng)基為WP培養(yǎng)基，附加細胞分裂素6-BA0.5mg/l，細胞分 裂素TDZ0. 005mg/l，生長素IBA0.Olmg/l，庶糖 30g/l，水晶洋菜 2g/L。
[0017] 步驟如中，所述的LB液體培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度為40mg/L。
[00化]步驟扣中，所述WP液體培養(yǎng)基懸浮菌體的ODe。。值為0. 6。
[0019] 步驟5)中，所述分化篩選培養(yǎng)基為在分化培養(yǎng)基中，附加頭抱霉素濃度為200mg/ L，卡那霉素濃度為40mg/L。
[0020] 步驟6)中，所述不定芽伸長篩選培養(yǎng)基為WP，附加細胞分裂素6-BA0. 5mg/l，生 長素IBA0.Olmg/L，頭抱霉素200mg/L，卡那霉素40mg/L。
[0021] 步驟7)中，所述生根篩選培養(yǎng)基為1/2WP，頭抱霉素濃度為lOOmg/l，卡那霉素的 濃度為40mg/l，庶糖25g/L，水晶洋菜2g/L。
[0022] 有益效果；與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的鑛貸柳抗性苗的制備方法，確定了鑛貸柳采 用農桿菌介導的轉基因基本方法W及合適的轉化、培養(yǎng)條件，為林木植物基因功能研究和 遺傳改良提供一個新途徑。
【附圖說明】
[0023] 圖1是莖段分化培養(yǎng)圖；
[0024] 圖2是芽伸長培養(yǎng)圖；
[0025] 圖3是生根培養(yǎng)圖；
[0026] 圖4是完整的抗性植株圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明，該實施例可W使本領域技術人員 更全面地理解本發(fā)明，但不W任何方式限制本發(fā)明。
[00測 實施例1
[0029] 鑛貸柳組培苗W莖段分化不定芽的方式繼代繁殖。培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基為 1/2WP，庶糖25-30g/L，抑5. 8,水晶洋菜2g/L，121 ±rC，滅菌18min。附加的生長素、細胞分 裂素和抗生素均為過濾滅菌，加入高壓滅菌后冷卻到40°C左右的培養(yǎng)基中。在繼代約1個 月的試管苗上選取生長狀態(tài)基本一致的幼嫩莖段，剪成約l-2cm長的莖段作為外植體，接 種到分化培養(yǎng)基中預培養(yǎng)，如圖1所示。培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照3000-40001UX，光照時 間16h/d，預培養(yǎng)2-3d。挑取農桿菌D冊a的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，加入卡那霉素 40mg/L，于28°C振蕩培養(yǎng)（220-230巧m)，過夜；次日取1血轉接50血的LB液體培養(yǎng)基。培 養(yǎng)至一定濃度（進入指數(shù)生長期）；500化pm離屯、5-lOmin收集菌體，取適當WP液體培養(yǎng)基 懸浮菌體至ODe。。值為0. 6左右備用。將預培養(yǎng)后的外植體莖段浸入侵染菌液，超聲波10s， 輕微振蕩，充分浸泡10-20min左右，在無菌濾紙上吸去多余菌液，接種到分化培養(yǎng)基（不含 抗生素）上進行共培養(yǎng)。暗中共培養(yǎng)2-4d后，用加入頭抱霉素的無菌水洗漆6-8次W除去 農桿菌，無菌濾紙吸去多余的水分，接種到分化培養(yǎng)基（含相應量的頭抱霉素和卡那霉素） 上培養(yǎng)。lOd左右更換一次分化培養(yǎng)基，直至分化出可見卡那霉素抗芽，如圖2所示。將卡 那霉素抗性芽連同原外植體一同移入不定芽伸長篩選培養(yǎng)基，20d左右更換一次芽伸長培 養(yǎng)基。待抗性芽伸長至l-2cm左右，將每個抗性芽分離獨立接入生根篩選培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)， 如圖3所示，經過一段時間的繼代培養(yǎng)即可得到完整的抗性苗，如圖4所示。
[0030] 使用的各培養(yǎng)基，具體配方為：基本培養(yǎng)基；1/2WP+庶糖25g/L+水晶洋菜2g/L; 鑛貸柳莖段分化培養(yǎng)基；WP+6-BA0. 5mg/L+TDZ0. 005mg/L+NAA0. 01mg/L+ 庶糖 30g/L+ 水 晶洋菜2g/L;分化篩選培養(yǎng)基；分化培養(yǎng)基+頭抱霉素（cef)100mg/L+卡那霉素化an)40mg g/L;適合芽伸長的培養(yǎng)基配方為WP+6-BA0. 5mg/L+IBA0. 01mg/L+庶糖30g/L+水晶洋菜 2g/L;芽伸長篩選培養(yǎng)基；芽伸長培養(yǎng)基+頭抱霉素（cef) 100mg/L+卡那霉素化an)40mg/ L;適合生根的培養(yǎng)基配方為1/2WP+庶糖25g/L+水晶洋菜2g/L;生根篩選培養(yǎng)基；生根培 養(yǎng)基+頭抱霉素（cef) 100mg/L+卡那霉素化an) 30mg/L。
[0031] 實施例2
[0032] 基本培養(yǎng)基只能維持植物的生存W及最低的生理活動需求，因此需要在基本培養(yǎng) 基中添加細胞分裂素KT和6-BA。鑛貸柳抗性苗的制備方法同實施例1，其中采用不同濃度 的細胞分裂素進行不定芽誘導，各濃度和結果如表1和表2所示。
[0033] 表16-BA對鑛貸柳不定芽誘導的影響
[0034]
[0037] 出芽率（％ )=萌芽的外植體個數(shù)/接種的外植體總個數(shù)X 100%。
[0038] 褐化率（％ )=褐化的外植體個數(shù)/接種的外植體總個數(shù)X 100%。
[0039] 通過對表1、表2結果分析可W得出，不同濃度的細胞分裂素對不定芽的誘導有不 同的影響。隨著6-BA濃度的增加，鑛貸柳外植體的出芽率不斷增加，6-BA濃度達到一定值 之后，出芽率開始降低，呈拋物線式的規(guī)律，同時隨著6-BA濃度的增加，外植體的褐化率不 斷增加；當KT濃度增加時，鑛貸柳外植體的出芽率也呈拋物線式變化，褐化率會隨之升高； 比較兩組實驗結果，添加6-BA出芽率略高，因此本申請?zhí)砑拥?-BA濃度最優(yōu)為0. 5mg/L。
[0040] 實施例3
[0041] 基本培養(yǎng)基只能維持植物的生存W及最低的生理活動需求，因此需要在基本培養(yǎng) 基中添加TDZ和NAA。鑛貸柳抗性苗的制備方法同實施例1，其中采用不同濃度的TDZ和 NAA進行培養(yǎng)，結果如表3。
[0042] 表3不同濃度的TDZ、NAA組合對不定芽增殖的影響
[0043]
[0044] 芽增殖系數(shù)=增殖外植體數(shù)/外植體總數(shù)X100%。
[0045] 從表3可知，TDZ濃度對不定芽增殖有非常顯著的影響，能夠有效的誘導外植體產 生不定芽。NAA促進細胞伸張，芽的生長，對不定芽的生長有重要作用。利用不同的TDZ與 NAA濃度組合能夠顯著促進不定芽分化。不同的TDZ和NAA濃度組合對芽增殖有不同的促 進作用，由結果得出合適的TDZ和NAA的組合濃度分別為0. 005mg/L、0.Olmg/L。
[0046] 實施例4
[0047] 鑛貸柳抗性苗的制備方法同實施例1，其中采用不同預培養(yǎng)時間進行培養(yǎng)，結果如 表4。
[0048] 表4預培養(yǎng)時間對轉化率的影響
[0049]

[005