一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物表面活性劑的制備方法，特別是涉及一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物表面活性劑是表面活性劑的一種，由微生物產(chǎn)生，是既含有親水基團(tuán)又含有疏水基團(tuán)的兩親性生物大分子物質(zhì)。與化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑除具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和增加泡沫等作用外，還具有如下特點:(I)高表面與界面活性，(2)生物降解性，(3)低毒性，(4)原材料的易獲得性，(5)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，(6)結(jié)構(gòu)特異性。截止目前，已報道的可產(chǎn)生物表面活性劑的菌株達(dá)上百株，隸屬于真菌、酵母、細(xì)菌等多個屬。其來源多樣，可產(chǎn)多種生物表面活性劑。
[0003]生物表面活性劑在石油、石化、環(huán)境管理、農(nóng)藥、食品、飲料、化妝品、醫(yī)藥、干洗、冶礦業(yè)等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力，它們可以被用作乳化劑、破乳劑、潤濕劑與發(fā)泡劑、功能性食品配料和洗滌劑。隨著消費者環(huán)保意識的提高，環(huán)境友好的生物制品越來越受到青睞。
[0004]然而在我國，生物表面活性劑還沒有大規(guī)模生產(chǎn)，具有研宄發(fā)展的空間。特別是，利用從海岸灘涂篩選的紅球菌制備生物表面活性劑的方法更處于研宄探討之中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其目的在于利用從海岸灘涂淤泥中分離篩選出的紅球菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)、酸沉淀、離心分離、有機(jī)溶劑萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，制成具有高表面活性的生物表面活性劑成品。
[0006]本發(fā)明的紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法所采用的生產(chǎn)菌為紅球菌SY095 (Rhodococcus sp.SY095)，從海岸灘涂派泥中分離篩選而獲得，該微生物菌種己于2015年04月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.10724。保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0007]本發(fā)明所述紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，技術(shù)步驟包括菌種活化、菌種種子液培養(yǎng)、菌種發(fā)酵培養(yǎng)和生物表面活性劑制備。
[0008]S1、菌種活化
[0009]將紅球菌菌種接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行活化，30°C溫箱培養(yǎng)Id?2d。
[0010]所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆油15?25g/L，尿素2?4g/L，K2HPO40.5?1.5g/L，KH2PO40.5 ?lg/L，MgSO4.7H20 0.25 ?0.75g/L，pH 7.0 ?8.0,1.5% 瓊脂，121 °C 滅菌30mino
[0011]S2、菌種種子液培養(yǎng)
[0012]將步驟SI活化后的紅球菌菌種接種于500mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C ±3°C、搖床轉(zhuǎn)速160rpm?200rpm條件下培養(yǎng)Id?2d，獲得種子液。
[0013]所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆油15?25g/L，尿素2?4g/L，K2HPO40.5?1.5g/L，KH2PO40.5 ?lg/L, MgSO4.7H20 0.25 ?0.75g/L，pH 7.0 ?8.0，121°C滅菌 30min。
[0014]S3、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
[0015]將步驟S2培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵罐的50L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ± 3°C、攪拌速度120rpm?180rpm，溶氧25%?35%條件下培養(yǎng)1h?36h，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0016]S4、生物表面活性劑制備
[0017]將S3步驟獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)酸沉淀、離心分離、有機(jī)溶劑萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得生物表面活性劑成品。具體步驟為:
[0018]步驟S3發(fā)酵停止后，下罐，用HCl (5N)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH值至2±0.5pH，室溫靜置4?24h ;撇取浮于發(fā)酵培養(yǎng)液表面的膏狀物，在4°C?8°C、轉(zhuǎn)速1000rpm?15000rpm條件下高速離心分離，去除多余水分；然后，將膏狀物使用有機(jī)溶劑氯仿/甲醇(1:1)溶液萃取，70°C?90°C，轉(zhuǎn)速60rpm?10rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，獲得生物表面活性劑成品。
[0019]本發(fā)明利用紅球菌制備的生物表面活性劑，對石油具有良好的乳化作用，工藝簡便，便于應(yīng)用推廣。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明所述紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法的流程簡圖。圖中標(biāo)記說明:
[0021]S1、菌種活化
[0022]S2、菌種種子液培養(yǎng)
[0023]S3、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
[0024]S4、生物表面活性劑制備
【具體實施方式】
[0025]以下通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述。
[0026]實施例1、配制發(fā)酵培養(yǎng)基
[0027]發(fā)酵培養(yǎng)基為無機(jī)鹽培養(yǎng)基。
[0028]配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基60L:尿素 150g，K2HP0460g，KH2P0445g，MgS04.7H20 30g，加自來水定容至60L，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入大豆油1200g，121°C滅菌30min。
[0029]配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基10mL:尿素 0.25g，K2HP040.lg，KH2P040.075g，MgS04.7Η20
0.05g，加蒸飽水定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.0，加入大豆油2g，121°C滅菌30min。
[0030]實施例2、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
[0031]將紅球菌單菌落先接種于固體培養(yǎng)基斜面，30°C溫箱培養(yǎng)ld，然后用接種針挑取單菌落接種于500mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C、搖床轉(zhuǎn)速160rpm條件下培養(yǎng)ld，獲得種子液；將種子液全部接種于50L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C、攪拌速度160rpm，通氣量30slpm(保證溶氧30% )條件下培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0032]實施例3、制備生物表面活性劑成品
[0033]發(fā)酵停止后，下罐，用HCl (5N)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH值為2，室溫靜置6h ;撇取浮于發(fā)酵培養(yǎng)液表面的膏狀物，4°C、轉(zhuǎn)速15000rpm條件下，高速離心，去除多余水分；將膏狀物使用氯仿/甲醇(1:1)溶液抽提，70°C，轉(zhuǎn)速80rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥獲得生物表面活性劑成品
1.128kgo
[0034]實施例4、表面活性檢測
[0035]表面活性初步檢測采用排油圈法。
[0036]取直徑1cm的培養(yǎng)皿，加入15mL蒸餾水，再取5mL液體石蠟倒于蒸餾水表面，液體石蠟在水面上形成穩(wěn)定的油膜。吸取500 μ L樣品滴在油膜中央，觀察記錄不同菌株的發(fā)酵液排油圈大小。
[0037]表面活性精確檢測采用鉑金板法，利用全自動表面/界面張力儀AlOl實現(xiàn)。
[0038]表面活性檢測結(jié)果:排油圈達(dá)到6cm，通過儀器測量表面張力為28mN/m。所獲得的生物表面活性劑成品的活性比常規(guī)生物表面活性劑活性提高10%。
【主權(quán)項】
1.一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其特征在于:其操作步驟包括菌種活化(SI)、菌種種子液培養(yǎng)(S2)、菌種發(fā)酵培養(yǎng)(S3)和生物表面活性劑制備(S4);菌種活化(SI)是將從海岸灘涂淤泥中分離篩選而獲得紅球菌SY095接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行活化，菌種種子液培養(yǎng)(S2)是將SI步驟活化后的紅球菌菌種接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得種子液，菌種發(fā)酵培養(yǎng)(S3)是將S2步驟培養(yǎng)的種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，生物表面活性劑制備(S4)是將S3步驟獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)酸沉淀、離心分離、有機(jī)溶劑萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得生物表面活性劑成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其特征在于，所述紅球菌的菌種為紅球菌SY095 (Rhodococcus sp.SY095)，從海岸灘涂淤泥中分離篩選而獲得，己于2015年04月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.10724。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其特征在于，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆油15?25g/L，尿素2?4g/L，K2HPO4 0.5?1.5g/L，KH2PO4 0.5?Ig/L，MgSO4.7H20 0.25 ?0.75g/L，pH 7.0 ?8.0，121。。滅菌 30min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其特征在于，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:大豆油15?25g/L，尿素2?4g/L，K2HPO40.5?1.5g/L，KH2PO40.5 ?lg/L，MgSO4.7H20 0.25 ?0.75g/L，pH 7.0 ?8.0，1.5%瓊脂，121°C滅菌 30min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其特征在于，所述菌種活化(SI)是將紅球菌菌種接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行活化，30°C溫箱培養(yǎng)Id?2d。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其特征在于，所述菌種種子液培養(yǎng)(S2)是將步驟S I活化后的紅球菌菌種接種于500mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C ±3°C、搖床轉(zhuǎn)速160rpm?200rpm條件下培養(yǎng)Id?2d，獲得菌種種子液。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其特征在于，所述菌種發(fā)酵培養(yǎng)(S3)是將步驟S2獲得的菌種種子液接種于50L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30±3°C、攪拌速度120rpm?180rpm，溶氧25%?35%條件下培養(yǎng)1h?36h，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，其特征在于，所述生物表面活性劑制備(S4)是在步驟S3發(fā)酵停止后，下罐，用HCl (5N)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH值至2±0.5pH，室溫靜置4?24h后撇取浮于發(fā)酵培養(yǎng)液表面的膏狀物，在4°C?8°C、轉(zhuǎn)速1000rpm?15000rpm條件下高速離心，去除多余水分；然后，將膏狀物使用氯仿/甲醇(I: D溶液抽提，70°C?90°C，轉(zhuǎn)速60rpm?10rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，獲得生物表面活性劑成品O
【專利摘要】本發(fā)明公開一種紅球菌產(chǎn)表面活性劑的制備方法，利用從海岸灘涂淤泥中分離篩選出的紅球菌，經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑。技術(shù)步驟包括菌種活化、菌種種子液培養(yǎng)、菌種發(fā)酵培養(yǎng)和生物表面活性劑制備。將紅球菌菌種先接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行活化，然后接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得種子液，再將種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，然后將發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)酸沉淀、離心分離、有機(jī)溶劑萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，制成具有高表面活性的生物表面活性劑成品。本發(fā)明涉及的紅球菌生物表面活性劑，制備工藝簡便，具有對石油很好的乳化作用，制備方法便于推廣應(yīng)用，有很好的市場應(yīng)用潛力。1072420150416
【IPC分類】C12R1/01, C12P1/00
【公開號】CN104988182
【申請?zhí)枴緾N201510403950
【發(fā)明人】郝建安, 張雨山, 王靜, 張曉青, 姜天翔, 杜瑾, 楊波, 司曉光, 張愛君, 邱金泉
【申請人】國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月10日