糙皮側(cè)耳發(fā)酵液的制備方法及該發(fā)酵液在降解黃曲霉毒素b1中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物發(fā)酵，特別是指一種趟皮側(cè)耳發(fā)酵液的制備方法及該發(fā)酵液在 降解黃曲霉毒素Bi中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 趟皮側(cè)耳俗稱(chēng)平茹，是一種形成子實(shí)體的真菌，其生長(zhǎng)環(huán)境不同分為野生和人工 栽培兩種。因子實(shí)體中含有豐富營(yíng)養(yǎng)成分可W食用，又稱(chēng)為食用菌。由大量測(cè)定數(shù)據(jù)得知， 每100克干茹中約含有粗蛋白20克、粗脂肪4克、碳水化合物50克、粗纖維6克，還含有礦 物質(zhì)、多種維生素和多種微量元素等。其蛋白質(zhì)含量是雞蛋的2. 6倍，豬肉的4倍；碳水化 合物含量占總量的65. 61 %，其中還原糖占54. 73% ;氨基酸約有18種，其中人體必需的8 種氨基酸含量較高，占氨基酸總量的35%W上，尤其作為病人的營(yíng)養(yǎng)品為佳。
[0003] 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，平茹性平，味甘，具有補(bǔ)虛、抗癌的功效，能改善人體新陳代謝，增強(qiáng) 體質(zhì)，調(diào)節(jié)植物神經(jīng)。平茹含有多糖體，對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，且具有免疫特性。平 茹還有追風(fēng)散寒、舒筋活絡(luò)的作用，可治腰腿疼痛，手足麻木，經(jīng)絡(luò)不適等癥，此外，平茹還 對(duì)肝炎、慢性胃炎、胃及十二脂腸潰瘍，軟骨病、高血壓等都有療效，對(duì)降低血膽固醇和防治 尿道結(jié)石也有一定療效，對(duì)女性更年期綜合癥可起到調(diào)理作用。
[0004] 趟皮側(cè)耳菌在含有營(yíng)養(yǎng)的固形物上生長(zhǎng)可W形成子實(shí)體供食用，還可進(jìn)行菌絲深 層液體發(fā)酵，培養(yǎng)液中分泌有大量多糖、酶、氨基酸及生理活性物質(zhì)。多糖W酸性多糖為主， 含有0-1，3-葡聚糖，半乳糖，甘露糖，葡萄糖醒酸等。經(jīng)科學(xué)研究證實(shí)，液體發(fā)酵復(fù)合產(chǎn)物 對(duì)肉瘤S180抑制率為91 %，提取的糖蛋白對(duì)體外S180有較強(qiáng)的抑制作用。趟皮側(cè)耳糖膚 組分有促進(jìn)淋己因子激活殺傷（LAK)細(xì)胞和自然殺傷（NK)細(xì)胞殺傷腫瘤作用。還具有降 血脂及防治動(dòng)脈粥樣硬化，可明顯減輕血清及肝膽固醇和甘油=醋。在發(fā)酵液中的多種酶， 尤其種酪氧化酶含量較高。該些酶可用于食品保鮮和穩(wěn)定，可催化多項(xiàng)化學(xué)反應(yīng)，改變 原分子結(jié)構(gòu)合成新物質(zhì)，改變分子物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)，利用該一特點(diǎn)進(jìn)行污水處理保護(hù)環(huán)境。
[0005] 黃曲霉毒素是一類(lèi)對(duì)人和動(dòng)物毒性極強(qiáng)物質(zhì)，是黃曲霉和寄生曲霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中 的次級(jí)代謝產(chǎn)物。1993年被世界衛(wèi)生組織（WHO)癌癥機(jī)構(gòu)劃定為1類(lèi)致癌物。產(chǎn)生黃曲霉 毒素的真菌普遍存在于自然界的±壤、農(nóng)作物及果實(shí)、牧草、飼料中，特別在大豆、稻谷、玉 米、花生中，在牛奶及奶制品中也經(jīng)常檢出其毒素。在每年的夏秋季節(jié)，溫度較高，空氣濕度 大，糧食作物在成熟前期很容易被霉菌污染，尤其是病變?cè)缡斓姆N粒極易生長(zhǎng)霉菌并產(chǎn)生 霉菌毒素。人食用后可直接危害生命，動(dòng)物采食后危害動(dòng)物生命或降低動(dòng)物生產(chǎn)性能。人 接觸黃曲霉毒素的主要來(lái)源是膳食污染的食物，污染食物有兩種類(lèi)型，一是由被黃曲霉毒 素污染的植物種子食物中攝入；二是被黃曲霉毒素污染的飼料進(jìn)入畜、禽體內(nèi)再轉(zhuǎn)入奶、蛋 及肉制品中被人攝入，最終危害人類(lèi)生命健康。高秀芬等人在2010年抽查了吉林、河南、湖 北、四川、廣東、廣西6省的玉米飼料樣品279份，黃曲霉毒素陽(yáng)性率為75. 63%，平均濃度 44. 04yg/kg，濃度范圍0. 20-888. 30yg/kg;四川農(nóng)大張自強(qiáng)2008年-2009年測(cè)定了全國(guó) n個(gè)省份共計(jì)1013份飼料樣品，其中黃曲霉毒素Bi(AFBi)檢出率高達(dá)99. 51 %，尤其W棉 稍、菜稍、玉米含量較高。
[0006] 黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織的破壞作用，發(fā)生肝炎，肝硬化，嚴(yán) 重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。在天然污染的食物中W黃曲霉毒素Bi最多見(jiàn)，其毒性和致癌性 也最強(qiáng)。經(jīng)研究得知，黃曲霉毒素Bi大鼠的半致死量雄性（lOOg)為7.2毫克/公斤體重、 雌性（150g)為17. 9毫克/公斤體重，屬特劇毒的毒物范圍（它的毒性比氯化鐘大10倍， 比祗霜大68倍）。中毒后臨床表現(xiàn)有胃部不適，食欲減退，惡心嘔吐，腹脹及肝區(qū)觸痛等， 嚴(yán)重者出現(xiàn)水腫，昏迷，抽搖而死。黃曲霉毒素Bi(AFBi)是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)致癌物，其致癌 力是奶油黃的900倍，比二甲基亞硝胺誘發(fā)胃、腎、直腸、乳腺、卵巢及小腸等部位癌變幾率 高75倍。黃曲霉毒素Bi(AFBi)與其它有毒無(wú)機(jī)化合物，如氯化鐘的毒性相比，其毒性機(jī)理 更為復(fù)雜，它主要是通過(guò)抑制核酸和蛋白合成，干擾糖類(lèi)、脂類(lèi)代謝，抑制免疫，降低激素活 性，抑制細(xì)胞ATP合成等，從而導(dǎo)致碳水化合物和脂類(lèi)代謝及蛋白合成的抑制，使細(xì)胞失去 活性，造成中毒。所W它又是一種細(xì)胞毒素。為此，黃曲霉毒素Bi危害已經(jīng)成為人們關(guān)注 的焦點(diǎn)。
[0007] 黃曲霉毒素Bi(AFBi)難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酬和氯仿等有機(jī)溶劑，耐高溫， 分解溫度為268°C，W上特點(diǎn)決定黃曲霉毒素的分離、降解難度大。解除黃曲霉毒素危害的 型式為分離去除和分解化學(xué)結(jié)構(gòu)失去毒性。近年來(lái)人們采用的解毒方法分為物理方法、化 學(xué)方法和生物方法。物理法為水洗、礦物質(zhì)吸附、射線福照等，此法勞動(dòng)強(qiáng)度大，礦物質(zhì)吸附 飽和度限制了對(duì)飼料的處理量，福照解毒不徹底；化學(xué)法均采用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和強(qiáng)氧化劑等化 學(xué)試劑降解毒素，其特點(diǎn)是降解毒素徹底，飼料營(yíng)養(yǎng)成分有不同程度破壞，均有化學(xué)殘留， 給家禽、家畜帶來(lái)二次傷害（二次污染）；生物學(xué)法是近年來(lái)研究較多方法，也是人們最重 視的方法。大量研究結(jié)果表明，生物學(xué)法是最可靠最科學(xué)的解毒方法，其特點(diǎn)是條件溫和， 副作用小，不產(chǎn)生二次污染，不破壞營(yíng)養(yǎng)成分等，越來(lái)越受到人們的重視。食用真菌菌絲體 深層液體發(fā)酵產(chǎn)物多含有降解黃曲霉毒素的活性成分，也是人們研究較多的菌種。
[000引微生物發(fā)酵制劑降解黃曲霉毒素主要采用細(xì)菌和真菌，國(guó)外大量資料研究顯示結(jié) 果為，真菌多但細(xì)菌報(bào)道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供趟皮側(cè)耳發(fā)酵液的制備方法及該發(fā)酵液在降解黃曲霉毒 素Bi中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：
[0011] 趟皮側(cè)耳發(fā)酵液的制備方法，是將趟皮側(cè)耳（Pleurotusostreatus)CICC14012接 種于含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及微量元素的無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液；
[0012] 發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的原料組成：
[001 引 ±豆淀粉 6.0 % -7.0 %，庶糖 1.8 % -2. 2 %，酵母膏 0. 18 % -0. 22 %，硫酸 錠 0. 29 % -0. 33 %，磯酸二氨鐘 0. 25 % -0. 30 %，硫酸儀 0. 15 % -0. 18 %，維生素 Bi0. 0001 % -0. 0003 %，微量元素溶液 5. 0 % -6. 0 %，襲蘆醇 430yL/1-470yL/1，吐溫 80 0. 1% -0. 13%，余量為無(wú)菌水，pH= 4. 9-5. 3 ;
[0014]微量元素溶液由W下原料組成：
[0015] 氯化巧1500mg，硫酸亞鐵150mg，硫酸鋒lOOmg，硫酸銅150mg，硫酸鋪lOOOmg，硫酸 鉆200mg，硫酸侶鐘20mg，棚酸lOmg，鋼酸鋼20mg，定容至1000血；
[0016] 通氣發(fā)酵的工藝條件如下：
[0017]接種量為體積比=6-8 : 100,溫度為26°C-28°C，通氣量為1 : 0. 7-1. 2vvm，壓 力為0. 03Mpa-0. 05Mpa，培養(yǎng)周期為不低于240小時(shí)。
[001引可W顯而易見(jiàn)的是發(fā)酵終點(diǎn)的控制除時(shí)間因素外，應(yīng)結(jié)合722可見(jiàn)光分光光度 計(jì)，采用考馬斯亮藍(lán)法監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度，確定發(fā)酵終點(diǎn)。
[0019] 采用上述方法制備的趟皮側(cè)耳發(fā)酵液在降解黃曲霉毒素Bi中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的具體技術(shù)構(gòu)思還有：
[0021] 出于工業(yè)化生產(chǎn)的需要，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的趟皮側(cè)耳菌種在接入無(wú)菌發(fā) 酵培養(yǎng)基前經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0022] 更為優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)包括斜面菌種的制備、平皿菌種制備、一 級(jí)種子的制備W及二級(jí)種子的制備。
[0023] 斜面菌種的制備采用馬鈴馨培養(yǎng)基，平皿菌種的制備采用葡萄糖培養(yǎng)基，溫度為 25°C-27°C，培養(yǎng)周期為4-5天。
[0024] 一級(jí)種子的制備W及二級(jí)種子的制備中種子培養(yǎng)基采用如下質(zhì)量百分含量的原 料組成：
[002引 ± 豆汁 18 % -21 %，葡萄糖 1. 8 % -2. 2 %，酵母膏 0. 25 % -0. 30 %，硫酸 錠 0. 29 % -0. 33 %，磯酸二氨鐘 0. 25 % -0. 30 %，硫酸儀 0. 15 % -0. 18 %，維生素 Bi0. 0001% -0. 0003%，微量元素溶液 3. 5% -4. 5%，余量為無(wú)菌水，pH= 5. 0-5. 5 ;
[0026] 微量元素溶液由如下質(zhì)量的原料組成：
[0027] 氯化巧1500mg，硫酸亞鐵150mg，硫酸鋒lOOmg，硫酸銅150mg，硫酸鋪lOOOmg，硫酸 鉆200mg，硫酸侶鐘20mg，棚酸lOmg，鋼酸鋼20mg，定容至1000血。
[002引一級(jí)種子的制備采用如下工藝步驟：
[0029] 挑選生長(zhǎng)旺盛、健壯的平皿菌種，在菌絲生長(zhǎng)旺盛部位切成直徑7mm-13mm圓片， 按每瓶3-5片接種量將其接種到裝有一級(jí)種子培養(yǎng)基=角瓶中，在溫度為26°C-28C條件 下振蕩培養(yǎng)85-96小時(shí)制成一級(jí)種子；裝量為1000ml的S角瓶裝入160-200ml-級(jí)種子培 養(yǎng)基，W目測(cè)一級(jí)種子培養(yǎng)基中有一定量的菌絲體懸浮，W鏡檢菌絲體生長(zhǎng)粗壯、均勻一致 為一級(jí)種子培養(yǎng)終點(diǎn)。
[0030] 二級(jí)種子的制備采用如下工藝步驟：
[0031] 按照一級(jí)種子與二級(jí)種子培養(yǎng)基的體積比=9-11 : 100的比例，將一級(jí)種 子接入滅菌后裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，