一種檢測hdr鹽單胞菌的特異性引物對及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及微生物菌檢測技術領域，特別設及一種檢測皿R鹽單胞菌的特異性引 物對及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 油井在生產(chǎn)過程中，隨著溫度、壓力的降低和氣體的析出，達到一定條件時，原油 中溶解的蠟就會結晶、析出。隨著溫度、壓力的進一步降低，石蠟將不斷地析出，其結晶體便 聚集和沉淀在油管、套管、抽油桿、抽油累等管材和設備上，該種現(xiàn)象稱為結蠟。油井結蠟會 嚴重影響油田的正常生產(chǎn)，油管壁結蠟會增加對地層的回壓，降低油井產(chǎn)量，嚴重甚至將井 筒通道堵死，造成油井停產(chǎn)；油管和抽油桿間的結蠟會增大抽油機載荷，甚至造成抽油累蠟 卡；地層射孔炮眼累入口處結蠟，會增大油流阻力，降低累效；油層內(nèi)部結蠟會大幅度降低 其液相滲透率，使油井大幅度減產(chǎn)甚至不出油。
[0003] 近年來微生物防蠟技術克服了傳統(tǒng)防蠟技術的缺點，不會造成地層傷害，不會產(chǎn) 生油井怠產(chǎn)，不會污染環(huán)境，可廣泛應用于各種含蠟油井，是一種新型、經(jīng)濟、環(huán)保的油井防 蠟技術，因此越來越受到石油工業(yè)的重視。該技術針對原油含蠟的特點W及結蠟機理，篩選 合適的細菌組合注入井筒，利用微生物及其代謝產(chǎn)物的作用，阻止石蠟結晶，防止或緩解井 筒結蠟，達到代替或逐漸替代傳統(tǒng)防蠟措施的目的。
[0004] 在江漢油田、克拉瑪依油田、江蘇油田近年來油井微生物防蠟技術進行了大規(guī)模 的推廣應用，取得了較好的效果。該技術應用最主要的菌種為鹽單胞菌（盛皿W35)，簡稱 皿R，是微生物防蠟的重要菌種，目前對于該一重要功能菌的檢測存在一定的難度。在定量 分析方面，目前只能根據(jù)不同微生物克隆數(shù)通過分子生物學方法確定石油姪降解菌在樣品 中的相對含量，并結合樣品總菌濃巧日生物顯微鏡計數(shù)等）進行計算獲得，由于油井產(chǎn)出液 等環(huán)境的待測樣品一般包含種類繁多、組成復雜的微生物，而且不同微生物的豐度相差巨 大。在采用傳統(tǒng)方法分析時，一方面，生物顯微鏡計數(shù)誤差較大，且不能做低濃度檢測；另一 方面，對于豐度低的微生物，在DNA提取分析過程中可能會出現(xiàn)漏檢；對于不同生理特性的 微生物，往往因為培養(yǎng)條件不適也會造成漏檢，同時，傳統(tǒng)方法存在著耗時長、過程繁雜等 一系列缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的針對現(xiàn)有技術中檢測鹽單胞菌方法存在的問題，提供一種檢測皿R鹽單 胞菌的特異性引物對，W便于精確檢測油田產(chǎn)出液中皿R鹽單胞菌的濃度。
[0006] 本發(fā)明的目的該樣實現(xiàn)的，一種檢測皿R鹽單胞菌的特異性引物對，其特征在 于，包括如下正向引物和反向引物： HaloF:ACGGCATCCGGAACTGTCA化loR:TCCGATCCGGACTGAGACC。
[0007] 本發(fā)明還提供一種采用上述特異性引物對檢測皿R鹽單胞菌濃度的檢測方法，包 括如下步驟： (1) 提取待測樣品中微生物的DM; (2) 采用上述檢測皿R鹽單胞菌的特異性引物對，對步驟（1)獲得的樣品DM進行巧光 定量PCR擴增，讀取巧光定量PCR擴增反應的Ct值； (3) 根據(jù)公式；CT= -3.4301gN+ 48.28 求得步驟l)中待測樣品中的石油姪降解菌 濃度N。
[0008] 進一步的，上述巧光定量PCR擴增的反應體系包括如下組分：9.5UL無菌水、 12.5uL化iversalSYBRGreenMasterMix、12.5uM的正向和反向引物各 0.5uL、2 yL待測樣品DM。
[0009] 進一步的，所述巧光定量PCR擴增的程序為；a)95。C保溫5min;b)94。C保 溫30s;c)64。C保溫30s;d)72。C保溫45S;e)重復執(zhí)行b)~d)50次；f)從65 。C開始每5S增加0. 5°C至達到95。C為止。
[0010] 為準確檢測皿R鹽單胞菌濃度，所述步驟3)中的公式Ct=-3. 4301gN+48. 28 通過如下方法擬合： A)取濃度為3. 23X109cells/血的石油姪降解菌液lOOmL，提取菌液中的DNA，溶于 無菌水中制得100yL的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀釋，分別得到濃度為3. 23X109、 3. 23X108、3. 23X107、3. 23X106、3. 23X105、3. 23X104、3. 23X1〇3的標準DNA溶液樣品； B) 將上步所得的各濃度的DM溶液分別采用化loF/化loR特異性引物對進行巧光定 量PCR擴增，并讀取巧光定量PCR擴增反應的Ct值，再根據(jù)IgN和CT值，擬合標準DNA溶 液樣品對應的菌濃與Ct值的標準曲線為： Ct= -3. 4301gN+ 48. 28,式中N為1yLDM標準樣品對應的細胞數(shù)。
[0011] 本發(fā)明中，設計了特異性引物對，再采用該特異性引物對對待測樣品中的DNA進 行巧光定量PCR擴增并讀取其CT值，再根據(jù)標準菌液定量擴增后的CT值與菌液濃度N的 IgN值按擬合的標準曲線W精確檢測待測樣品中皿R鹽單胞菌濃度，具有檢測快速、特異 性強、操作便捷、檢測準確的優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)皿R檢測技術的精度低，低濃度檢測時易出 現(xiàn)漏檢的問題，對現(xiàn)場油井微生物防蠟技術的推廣應用更具有指導意義。
【附圖說明】
[001引圖1為發(fā)明的皿R的標準DNA溶液的濃度與CT值的擬合曲線。
【具體實施方式】[001引實施例1 皿R的標準DNA溶液的濃度與Ct值的曲線的擬合。
[0014]A)取濃度為3. 23X109cells/mL的石油姪降解菌液100血，采用A巧gen?細菌基 因組DNA提取試劑盒（Axygen生物科技有限公司，美國）提取菌液中的DNA，溶于無菌水中 制得100化的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀釋，分別得到濃度為3. 23EX10\3. 23X108、 3. 23X107、3. 23Xl〇e、3. 23Xl〇s、3. 23X1〇\3. 23X103的標準DNA溶液樣品； B)將上步所得的各濃度的DNA溶液分別采用化loF/化loR特異性引物對進行巧光定量PCR擴增，其中巧光定量PCR擴增反應體系的組分為；9. 5uL無菌水、12. 5uL化iversal SYBRGreenMasterMix、12.5uM的正向和反向引物各0.5uL、2uL樣品DM。巧光定 量PCR擴增的反應程序；a)95。C保溫5min;b)94。C保溫30s;一64。C保溫30s; d)72。C保溫45s;e)重復執(zhí)行b)~d)50次；f)從65。C開始每5S增加0. 5。C 至達到95 °C為止；g)讀取巧光定量PCR擴增反應的Ct值。記錄各標準菌液的濃度N與 Ct值關系如表1。
[0015]
表中N示1 y LDNA樣品對應的細胞數(shù)。由于檢測時，該DNA溶液來源于100血樣品 的菌液提取的DNA溶于適量無菌水中制備得到的100 y LDNA溶液，經(jīng)RT-PCR巧光定量擴 增得到表1及標準曲線Ct=-3.430IgN+ 48. 28,標準曲線的擬合度R2=0.9952如圖 1所示。那么，樣品中的菌液濃度為：N(Cll/yL) X 100 yl/100血=N(Cell/mL) 因此，N即代表樣品菌濃，按照本標準曲線可W檢測lO4~1〇9Cell/mL菌液濃度的現(xiàn)場樣品， 另外，如果菌濃較低可W進行離屯、濃縮測定。
[001引 實施例2 比較例 針對某微生物防蠟措施的油井采出液，使用現(xiàn)有技術中的一種皿R的選擇性培養(yǎng)基 逐級稀釋平板培養(yǎng)測定和本方法同時測定采出液水體中皿R純菌濃度，采用本發(fā)明的特 異性引物對檢測皿R鹽單胞菌濃度的檢測方法下簡稱RT-PCR)檢測其菌濃為1. 18X105cells/mU平板方法為110000個/mU說明本方法和傳統(tǒng)方法檢測結果吻合。記錄 結果如表2所示。
[0017]
實施例3 油田產(chǎn)出液樣品中石油姪降解菌濃度的檢測 分別取江蘇油田不同地質(zhì)條件下的五口油井的采出液lOOmU分別記為油井1、油井 2、油井3、油井4、油井5 ;將上采出液樣品分別采用Axygen?細菌基因組DNA提取試劑盒 (Axygen生物科技有限公司，美國）提取菌液中的DNA，溶于無菌水中制得100yL的DNA溶 液。將上述DNA溶液分別采用本發(fā)明的RT-PCR方法進行巧光定量擴增，其中擴增反應的 體系為；9. 5uL無菌水、12. 5uLUniversalSYBRGreenMasterMix、12. 5uM的正向 和反向引物各0.5uL、2uL產(chǎn)出液樣品DM。具體的巧光定量擴增反應的程序為；a)95 。C保溫 5min;b)94。C保溫 30s;c)64。C保溫 30s;d)72。C保溫 45s;e)重 復執(zhí)行b)~d)50次；f)從65。C開始每5S增加0.5。C至達到95。C為止；g)讀 取巧光定量RT-PCR擴增反應的Ct值，并分別記錄上述各油井采出液樣品的DNA溶液經(jīng) RT-PCR擴增后的Ct值如表3,并根據(jù)標準曲線Ct= -3.430IgN+ 48. 28查出對應的Ig N值，最終求得各產(chǎn)出液樣品中皿R菌液的濃度，如表3所示。
[001引表3產(chǎn)出液樣品中石油姪降解菌濃度
【主權項】
1. 一種檢測HDR鹽單胞菌的特異性引物對，其特征在于，包括如下正向引物和反向引 物： HaloF: ACGGCATCCGGAACTGTCA HaloR: TCCGATCCGGACTGAGACC。2. -種HDR鹽單胞菌濃度的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 提取待測樣品中微生物的DNA ; (2) 采用權利要求1所述的特異性引物對，對步驟（1)獲得的樣品DNA進行熒光定量 PCR擴增，讀取熒光定量PCR擴增反應的Ct值； (3) 根據(jù)公式：CT = -3.4301gN + 48.28 求得步驟l)中待測樣品中的石油烴降解菌 濃度N。3. 根據(jù)權利要求2所述的HDR鹽單胞菌濃度的檢測方法，所述熒光定量PCR擴增的 反應體系包括如下組分：9.5 uL無菌水、12.5 uL Universal SYBR Green Master Mix、 12. 5 yM的正向和反向引物各0. 5 yL、2 yL待測樣品DNA。4. 根據(jù)權利要求2所述的HDR鹽單胞菌濃度的檢測方法，所述熒光定量PCR擴增的程 序為：a) 95 ° C 保溫 5 min ;b) 94 ° C 保溫 30 s ;c) 64° C 保溫 30 s ;d) 72 ° C 保溫 45 s; e)重復執(zhí)行b)~d)50次；f)從65 ° C開始每5 s增加0. 5° C至達到95 ° C為 止。5. 根據(jù)權利要求2所述的HDR鹽單胞菌濃度的檢測方法，所述步驟3)中的公式C T = -3. 4301g N + 48. 28通過如下方法擬合： A) 取濃度為3. 23X IO9 cells/mL的石油烴降解菌液100mL，提取菌液中的DNA，溶于 無菌水中制得100 U L的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀釋，分別得到濃度為3. 23X 109、 3. 23X 108、3. 23X 107、3. 23X 106、3. 23X 105、3. 23X 104、3. 23X IO3的標準 DNA 溶液樣品； B) 將上步所得的各濃度的DNA溶液分別采用HaloF/HaloR特異性引物對進行熒光定 量PCR擴增，并讀取熒光定量PCR擴增反應的(^值，再根據(jù)Ig N和C ^直，擬合標準DNA溶 液樣品與Ct值的標準曲線為： Ct = -3. 4301g N + 48. 28,式中N為I y L DNA標準樣品對應的細胞數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明的涉及微生物菌檢測技術領域，特別涉及一種檢測HDR鹽單胞菌的特異性引物對及其檢測方法。其中，一種檢測HDR鹽單胞菌的特異性引物對，包括如下正向引物和反向引物：HaloF: ACGGCATCCGGAACTGTCA；HaloR: TCCGATCCGGACTGAGACC。本發(fā)明中的HDR鹽單胞菌濃度的檢測方法采用該特異性引物對對待測樣品中的DNA進行熒光定量PCR擴增并讀取其CT值，再根據(jù)標準菌液定量擴增后的CT值與菌液濃度N的lg N值按擬合的標準曲線以精確檢測待測樣品中HDR鹽單胞菌濃度，具有檢測快速、特異性強、操作便捷、檢測準確的優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)HDR檢測技術的精度低，低濃度檢測時易出現(xiàn)漏檢的問題，對現(xiàn)場油井微生物防蠟技術的推廣應用更具有指導意義。
【IPC分類】C12R1/01, C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104988213
【申請?zhí)枴緾N201510290357
【發(fā)明人】姚峰, 王彪, 時維才, 林晶晶, 鄭海男, 雷世華
【申請人】中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司江蘇油田分公司
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年8月19日