一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因a3型突變的引物組及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于檢測大豆脂肪酸脫氨酶合成基因A3型突變的引物組及應(yīng) 用，屬于植物分子標(biāo)記開發(fā)和作物分子輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆為人類提供重要的植物油份，并且大豆的含油量是大豆最重要的經(jīng)濟(jì)性狀。 商品大豆油主要包括大約11 %的軟脂酸（16:0) ,4%的硬脂酸（18:0) ,25%的油酸（18:1)， 52%的亞油酸（18:2)和4%的亞麻酸（18:3HFe虹，2007)。中國各地區(qū)的氣候、±壤、水質(zhì) 等自然條件W及品種選育方向均存在差異，為大豆種質(zhì)資源品質(zhì)特性的豐富變異創(chuàng)造了條 件，有利于篩選優(yōu)異脂肪酸組成的大豆種質(zhì)（蓋均銳等，2001)。不飽和脂肪酸為人體必需 脂肪酸，在人體新陳代謝中具
[0003] 有重要的生理功能，油酸可有效降低血液中總膽固醇和有害膽固醇含量，營養(yǎng)學(xué) 家稱之為"安全脂肪酸"，亞油酸具有抑制癌癥，預(yù)防糖尿病和減少體內(nèi)脂肪，減少血液中膽 固醇量，防止動(dòng)脈硬化的作用，亞麻酸具有溶血栓，降血壓防血小板凝集，健腦抗衰老等作 用（陳學(xué)珍，2004)。在大豆油脂中的不飽和脂肪酸具有重要的生理保健作用，不飽和脂肪 酸中油酸的穩(wěn)定性最好，提高其含量可W延長貶藏期，但由于亞油酸和亞麻酸分別含有2， 3個(gè)不飽和雙鍵，容易使油脂氧化變質(zhì)，造成豆油及其食品味道不佳，營養(yǎng)價(jià)值降低。另外， 由于飽和脂肪酸能量低，不易消化吸收，過多食用會(huì)導(dǎo)致肥胖病和屯、血管疾?。盍?， 2006)。因此，提高油酸含量，降低亞油酸含量是大豆品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。
[0004] 在油脂的合成途徑中，脂肪酸脫氨酶2 (FAD2)在油酸前體向亞油酸前體的轉(zhuǎn)變過 程中起到了至關(guān)重要的作用（Okul巧等，1994 ;Schlueter等，2007)，在發(fā)育的大豆種子中， 2 個(gè)脂肪酸脫飽和酶GmFAD2-lA(Glymal0g42470)和GmFAD2-lB(Glyma20g24530)表達(dá)水平 最高，因此該2個(gè)基因被認(rèn)為是控制大豆油酸含量的候選基因，并且越來越多的研究者通 過改造該2個(gè)目標(biāo)基因來培育高油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆品種。基因工程和候選基因分子育種 策略被用來培育高于80%油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆炬U虹等，2002出oshino等，2010 ;化am等， 2010)，該些研究成果證明了在GmFAD2-lA和GmFAD2-lB基因中的突變程度越嚴(yán)重，大豆油 脂中的油酸含量越高，同時(shí)油脂的穩(wěn)定性也越強(qiáng)。
[0005] 我國作為大豆的發(fā)源地，具有豐富的大豆種質(zhì)資源。目前，我國作物種質(zhì)資源庫己 保存的大豆種質(zhì)資源達(dá)3萬余份，居世界之首（汪越勝，2002)。然而利用傳統(tǒng)的油分鑒定 方法對數(shù)目龐大的大豆資源進(jìn)行鑒定工作量大，周期長的問題，目前尚沒有一種能夠快速 并且準(zhǔn)確地檢測控制大豆高油酸含量的A3型突變位點(diǎn)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種大豆脂肪酸脫氨酶合成基因A3型突變位點(diǎn) 的快速檢測方法，所采取的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于檢測大豆脂肪酸脫氨酶合成基因A3型突變 的引物組，該引物組的核巧酸序列如SEQIDNO. 1-4所示。
[000引本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用所述引物組檢測大豆脂肪酸脫氨酶合成 基因A3型突變的方法，該方法是W待測樣品的DNA為模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2 所述序列為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物后，再W稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，W 如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述序列為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，最后利用高分辨率烙 解曲線分析儀器對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因型突變檢測。
[0009] 所述方法的步驟如下：
[0010] 1)提取待鑒定材料的DNA;
[001U2)W步驟1)所得的DNA為模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列為引物 進(jìn)行第一輪PCR巢式擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，進(jìn)行稀釋處理；
[001引如W步驟。中稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，W如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述序 列為引物進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后獲得第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0013] 4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分 辨率烙解曲線分析儀器對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型突變進(jìn)行檢測。
[0014] 優(yōu)選地，步驟2)所述第一輪巢式PCR處理，PCR擴(kuò)增條件為；94°C預(yù)變性4min， 94°C變性40s，6rC退火30s，72°C延伸15s，共35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫；所述 稀釋處理，是利用d地2〇稀釋10倍。
[0015] 優(yōu)選地，步驟3)所述第二輪巢式PCR處理，PCR擴(kuò)增條件為；94°C預(yù)變性4min， 94°C變性40s，59°C退火30s，72°C延伸10s，共15個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫。
[0016] 優(yōu)選地，步驟4)所述利用高分辨率烙解曲線分析儀器對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因 型突變進(jìn)行檢測，是根據(jù)目標(biāo)片段的GC含量的變化在不同烙解溫度出現(xiàn)吸收峰的位置判 定，突變株的GC含量下降，溶解溫度降低，吸收峰在左側(cè)；野生型GC含量高，烙解溫度高，吸 收峰在右側(cè)；雜合型的GC含量居中，吸收峰位于中間溫度。
[0017] 所述方法的具體步驟如下：
[00化]1)提取待鑒定材料的DNA;
[0019] 。W步驟1)所得的DNA為模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列為引 物進(jìn)行第一輪？〔3擴(kuò)增，？0?擴(kuò)增條件為；941：預(yù)變性4111111，941：變性4〇3,611：退火3〇3， 72°C延伸15s，共35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，利用d地20稀釋 10倍；
[0020] 3)W步驟2)中稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，W如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述 序列為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為；94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，59°C退 火30s，72°C延伸10s，共15個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，擴(kuò)增結(jié)束后獲得第二輪擴(kuò) 增產(chǎn)物.
[0021] 4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分 辨率烙解曲線分析儀器對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型突變進(jìn)行檢測，并將所得烙解曲線與野 生型和雜合型樣品的烙解曲線進(jìn)行對比，當(dāng)待測樣品的烙解溫度降低，烙解曲線位于野生 型和雜合型樣品的左側(cè)時(shí)，該待測樣品即為A3型突變株。
[0022] 所述任一方法用于大豆的遺傳育種。
[0023] 利用所述引物組制備的檢測試劑盒。
[0024] 所述試劑盒用于篩選和鑒定大豆脂肪酸脫氨酶合成基因A3型突變體。
[0025] 本發(fā)明有益效果：
[0026] 本發(fā)明是在克隆出的大豆脂肪酸脫氨酶合成基因GmFAD2-lA基礎(chǔ)上，通過比較高 油酸大豆A3和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lA基因序列，首次發(fā)現(xiàn)了位于76化P處的 單堿基突變佑一A)，且該突變導(dǎo)致油酸含量變化。
[0027] 本發(fā)明針對A3突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了 2套分子標(biāo)記（外部引物和內(nèi)部引物，引物如序列 表所示）進(jìn)行巢式PCRW確保擴(kuò)增的特異性，并利用高分辨率烙解曲線分析儀器進(jìn)行突變 位點(diǎn)檢測。本發(fā)明開發(fā)的分子標(biāo)記的使用方法為；首先利用外部引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增， 隨后將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作模板，且W內(nèi)部引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，最后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn) 移至高分辨率烙解曲線分析儀器中進(jìn)行基因型突變檢測。該突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記開發(fā)對于 高油酸大豆的分子標(biāo)記輔助選擇具有重要意義。
【附圖說明】
[002引圖1為GmFAD-2-lA(