煙堿型乙酰膽堿受體的肽抑制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物化學(xué)，即設(shè)及能夠選擇性阻斷所述肌肉類型的煙堿型己酷膽堿受 體的新膚化合物。更具體而言，本發(fā)明設(shè)及施用該些使模擬的和年齡相關(guān)的皺紋平滑的化 合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 在過去幾十年中，已經(jīng)觀察到發(fā)達(dá)國家在預(yù)期壽命的穩(wěn)步增加。在2000年，美 國65歲W上的人有13%，在2030年，預(yù)期該個(gè)數(shù)目會升高達(dá)到20%。人口統(tǒng)計(jì)的變化要 求加快努力設(shè)計(jì)出對年長人有效的醫(yī)學(xué)治療。該種需求全面衡量設(shè)及美容皮膚學(xué)，其提 供強(qiáng)壯劑、抗衰老劑和防曬劑W及抗皺霜。美容和制藥公司經(jīng)常在該種霜?jiǎng)┲惺褂媚w作 為活性成分。膚和W其為基礎(chǔ)的美容具有不同的活性；刺激成纖維細(xì)胞活性、抑制參與膠 原蛋白降解的酶、血管生成刺激、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)黑色素生成、神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)阻滯。在霜?jiǎng)?中局部施用膚的最重要的缺點(diǎn)之一是它們滲入皮膚的能力下降。事實(shí)上，滲入皮膚的能 力取決于各種因素，如化合物的物理和化學(xué)條件（解離常數(shù)[pKa]、分子尺寸、穩(wěn)定性、溶 解度和親脂性系數(shù)）；滲透時(shí)間；可持續(xù)性、厚度和皮膚組成、皮膚新陳代謝；施用的區(qū)域、 面積和持續(xù)時(shí)間（Ranade，V.V.Drugdelivery巧stems. 6.Transdermal化ugdelivery. J.Clin.化armacol.1991，31，401-418)。如果膚對應(yīng)于W下列出的參數(shù)則它被認(rèn)為是合適 局部施用的工具，然而，必須指出的是，所有該些參數(shù)都是經(jīng)驗(yàn)性的，而非普適性的（Guy, R.比Currentstatusandfutureprospectsoftransdermaldrugdelivery.Pharm.Res.1996,13,1765-1769);
[0003] 1.分子量小于500Da
[0004] 2.親脂性系數(shù)值（辛醇/水體系的分配系數(shù)的對數(shù)值）為1至3。
[0005] 3.烙化溫度低于200C [000引 4.良好的水溶性（Img/血）
[0007] 5.無或幾乎沒有極性中屯、。
[0008] 美容學(xué)中所用的膚能夠分成四個(gè)主要類別；信號膚、酶抑制劑、載體膚和神經(jīng)肌 肉傳遞阻斷劑（GorouhiF，MaibachHI.Roleoftopicalpeptidesinpreventingor treatingagedskin.IntJCosmetSci.20090ct;31 巧）：327-4巧。盡管在使用該四個(gè)類 別的膚之后顯著的生理效應(yīng)類似，但它們的作用機(jī)理卻是顯著不同的。來自神經(jīng)肌肉傳導(dǎo) 阻斷劑的膚于是被視為治療年齡相關(guān)的和模擬的（mimic)皺紋的肉毒素（bo化lotoxin)注 射物的安全替代。高度特異性的肉毒桿菌毒素具有很多缺點(diǎn)，例如高毒性，并且因此，有必 要進(jìn)行精確的劑量計(jì)算、產(chǎn)品質(zhì)量必需依賴于生產(chǎn)條件、并僅僅用于注射之用。
[0009] 肌肉收縮是一種生理過程，在此過程之下肌肉經(jīng)歷提供機(jī)械工作的緊張-縮短或 拉長。該個(gè)過程為動物和人提供自發(fā)和非自發(fā)運(yùn)動的能力，并直接關(guān)系到消化、呼吸、防御、 分泌和其他生理過程。無橫紋肌肉負(fù)責(zé)非自發(fā)運(yùn)動，例如屯、室或腸道蠕動、血管和膀脫緊張 的變化。橫紋肌提供自發(fā)運(yùn)動-空間運(yùn)動、表情模仿（facemimics)、呼吸、吞咽等。屯、臟的 工作通過屯、臟肌肉收縮提供。
[0010] 肌肉通過多核肌纖維形成，每個(gè)纖維獨(dú)立地不僅是由細(xì)胞構(gòu)成的而且是擁有作為 肌原纖維的該種特定的"收縮"元件存在的生理單元。該些纖維絲聚集成第一階簇；幾個(gè)第 一階簇結(jié)合到一起而形成第二階簇等，引起肌肉形成。由于肌肉收縮是由來自中樞神經(jīng)系 統(tǒng)的脈沖引發(fā)的，肌肉上存在受神經(jīng)元軸突的突觸末端支配的區(qū)域。神經(jīng)元和肌纖維之間 的結(jié)稱為神經(jīng)肌肉突觸（醒巧。
[0011] 肌肉收縮的機(jī)理能夠分為幾個(gè)主要階段。第一階段是從神經(jīng)元發(fā)送W動作電位形 式的刺激。動作電位沿神經(jīng)原纖維傳播至其在肌纖維上的終端，該引起己酷膽堿（Ach)神 經(jīng)遞質(zhì)從NMS的突觸前部分向突觸間隙中釋放。該種神經(jīng)遞質(zhì)影響打開各個(gè)己酷膽堿口控 通道-己酷膽堿受體（A化時(shí)的僅僅一部分肌纖維膜（NMS的突觸后部分）。為了響應(yīng)通道 的打開，在肌纖維內(nèi)會存在鋼濃度升高而在細(xì)胞膜上引起沿著肌纖維膜縱向傳導(dǎo)的動作電 位的產(chǎn)生。動作電位使肌細(xì)胞膜去極化，引起巧離子從肌質(zhì)網(wǎng)（coplasmicreticulum)釋 放。巧離子直接發(fā)起肌肉收縮過程。借此巧累作用，巧被主動累送回肌質(zhì)網(wǎng)，引起肌肉松弛。
[0012] 己酷膽堿釋放的機(jī)理是公認(rèn)的。當(dāng)動作電位形式的神經(jīng)脈沖到達(dá)運(yùn)動神經(jīng)元的末 端時(shí)，它打開位于醒S的突觸前膜的巧通道。胞內(nèi)巧離子濃度的局部增加之后巧就會與提 供含有神經(jīng)遞質(zhì)Ach的突觸囊泡與質(zhì)膜融合的蛋白相互作用。該個(gè)過程也已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì) 研究，并在由S個(gè)蛋白一一囊泡表面蛋白神經(jīng)突觸蛋白、突觸融合蛋白和神經(jīng)元表面膜蛋 白SNAP-25的有效四螺旋聯(lián)結(jié)形成的復(fù)合物SNARE的輔助下進(jìn)行。復(fù)合物的形成引起囊泡 和質(zhì)膜的快速融合并誘導(dǎo)Ach胞外分泌至突觸間隙中。Ach分子擴(kuò)散（de化se)于整個(gè)具有 50-100nm的寬度的間隙中，并到達(dá)突觸后膜，由于存在高度特異性的受體一AchR，該突觸后 膜對神經(jīng)遞質(zhì)是非常敏感的。它們與Ach的結(jié)合起始了通道的打開；該引起鋼在細(xì)胞內(nèi)急 劇流入而鐘較弱地流出細(xì)胞，隨之如上所描述的，肌膜進(jìn)一步去極化，巧釋放而肌肉收縮。
[0013] 由將神經(jīng)遞質(zhì)Ach結(jié)合至A化R所致神經(jīng)沖動傳遞通過醒S的突觸后部分的機(jī)理 也進(jìn)行了充分的研究。有兩個(gè)主要的A化R的組一一煙堿型（nA化時(shí)和毒葦堿型（mA化時(shí)， 它們不同之處在于它們與激動劑的結(jié)合能力。具體而言，nA化R因其結(jié)合天然植物生物堿 煙堿的能力而得名，而mA化R因?yàn)榻Y(jié)合毒磨茹的葦毒堿生物堿的能力而得名。NA化R是親離 子受體，其在與配體結(jié)合之后對特異性離子是可滲透的。MAchR指的是一組代謝型受體；它 是包含與G-蛋白（pritein)相關(guān)的7個(gè)跨膜片段的單鏈蛋白。在該種情況下，在配體結(jié)合 之后信號傳輸遵照許多代謝途徑。
[0014] 在分子水平上nA化R是由5個(gè)亞單位構(gòu)成的寡聚蛋白。在膜中，5個(gè)亞單位已知 是圍繞存在具有2. 5皿的直徑的離子通道的中屯、軸線偽對稱性地組織的。該些數(shù)據(jù)對于 nA化R獲自電經(jīng)（To巧edo)的電器官；該種受體具有亞單位組成（a1)2-13 1-丫-5[Unwin N.Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at4Aresolution. J Mol Biol2005;346:967-89]。截至目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 10個(gè)a-亞單位（a1-a10)和 4個(gè)e亞單位（e1-0 4)的各種亞型。a-亞單位和P-亞單位（除a^和P1-)的所 有亞型都揭示于神經(jīng)元型nA化R中，其主要表達(dá)于中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi)， 在許多情況下，甚至表達(dá)于突觸前膜liDani JA，Bertrand D. nicotinic acet}dcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol2007;47:699-729]。動物和人類神經(jīng)肌肉觸突的突觸后 nA化R具有組成（a1)2-e1-丫 - 5 (等同于來自電器官的受體的組成），但卻處于生物體初 始（胚期）發(fā)展的階段。在成熟的形式中丫-亞單位被e-取代[YomotoN.，Wakats址i S.，Sehara-FujisawaA.2005.Theacetylcholinereceptorgamma-to-epsilonswitch occursinindividualendplates.Biochem.Biophys.Res.Commun. 331 ; 1522-1527]。在成 熟的肌肉中，僅僅具有結(jié)構(gòu)（a1)2-01-e-5的nA化R負(fù)責(zé)結(jié)合神經(jīng)遞質(zhì)，其引起肌肉收 縮。考慮到所有的nA化R亞單位的高度同源結(jié)構(gòu)，其在膜中的空間五聚體通道組成也認(rèn)為 是類似的。現(xiàn)在nA化R與經(jīng)典激動劑和競爭性括抗劑結(jié)合的區(qū)域也已被發(fā)現(xiàn)；兩個(gè)配體結(jié) 合區(qū)域位于大致在中間部分中朝著膜表面的受體的兩個(gè)a1-和相鄰的丫（〇-和5-亞 單位的主要N-末端胞外結(jié)構(gòu)域的接觸區(qū)域內(nèi)。
[0015] 為了對神經(jīng)元和肌肉纖維提供快速的信息傳輸，在神經(jīng)肌肉結(jié)的突觸后膜的重要 區(qū)域中需要高濃度的A化R。因此，A化R的聚集對于神經(jīng)肌肉結(jié)的正常功能發(fā)揮是至關(guān)重要 的出ochW. 1999.Formationoftheneuromuscularjunction.Agrinanditsunusual receptors.化r.J.Biochem. 265:1-10]。有幾種蛋白參與了該個(gè)聚集過程，主要是聚集蛋 白、rapsin和激酶MuSK(肌肉特異性激酶）。早期開發(fā)而現(xiàn)在不斷創(chuàng)新的阻斷神經(jīng)肌肉傳 遞的新藥劑旨在擾亂NMS突觸前膜或突觸的突觸后部分的正常功能發(fā)揮。
[0016] 美容行業(yè)已經(jīng)開展了若干各種工作而開發(fā)出新化合物用于模擬皺紋治 療期間的局部施用W避免肉毒桿菌毒素注射之后觀察到的副作用（LupoMP，Cole AL.Cosmeceuticalpeptides.DermatolTher. 2007,Sep-Oct;20 (5) : 343-9)。截至目前，已 知有幾種膚化合物能夠阻斷神經(jīng)肌肉傳遞（見表1)
[0017] 表1.阻斷神經(jīng)肌肉傳遞的膚的氨基酸序列及其生物活性。
[0018]
[0019] 膚抗皺紋膚是"肉毒桿菌毒素的美容類似物"中最好的一個(gè)炬lanes-MiraC，et al.Asynthetichexapeptide(Argireline)withanti-wrinkleactivity.IntJCosmet Sci. 2002 ;24(5) ;303-310)。在2000年初出現(xiàn)，迅速得到流行--現(xiàn)在它被用于旨在平滑 模擬皺紋的許多美容藥物中?？拱櫦y膚的六個(gè)氨基酸重復(fù)蛋白片段SNAP25,對于與突觸前 膜結(jié)合的突觸囊泡軸突所必需。在軸突中，抗皺紋膚與蛋白SNAP25競爭并插入到臨時(shí)復(fù)合 物SNARE中而將其代替一一直接在突觸與膜結(jié)合前由幾個(gè)膜蛋白形成該種復(fù)合物，而該對 于進(jìn)行成功的胞吐作用是必需的。缺陷復(fù)合物不能提供囊泡與膜的良好聯(lián)結(jié)，因此遞質(zhì)釋 放不會發(fā)生而肌肉就不會接收信號來收縮和保持放松。
[0020] 從蛋白SNAP25獲得并且旨在在突觸水平通過與SNAP25競爭復(fù)合物SNARE形成來 抑制神經(jīng)肌肉傳遞的抗皺紋膚類似物，描述于專利EP1180524HW09734620中。
[0021] 對志愿者研究的局部30天使用含10%抗