Ibv、csfv和ndv的高分辨熔解基因分型的制作方法
【專利說明】IBV、CSFV和NDV的高分辨膝解基因分型
[0001] 相關(guān)申請的香叉引用
[0002] 本申請要求2012年12月18日提交的美國臨時(shí)申請61/738, 688的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及使用高分辨烙解技術(shù)區(qū)分和表征IBV、CSFV和NDV毒株和鑒定新毒株 的方法。本發(fā)明還提供隨該類方法使用的底物和試劑盒。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)是一種引物延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)提供一種在體外擴(kuò)增特定 DNA或多核巧酸、產(chǎn)生數(shù)千個(gè)至數(shù)百萬個(gè)特定DNA序列副本的方法。PCR現(xiàn)在是醫(yī)學(xué)研究實(shí) 驗(yàn)室和生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室中用于多種應(yīng)用的常見和經(jīng)常不可替代的技術(shù)。該些應(yīng)用包括用 于測序、基于DNA的系統(tǒng)發(fā)生或基因功能分析的DNA克??；診斷遺傳疾?。昏b定遺傳指紋； 及檢測和診斷傳染病?；綪CR的某些變型包含定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR或RT-PCR)、等位基因 特異性PCR、非對稱PCR、熱啟動PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、巢式PCR、連接介導(dǎo)的PCR、序列 間特異性PCR、熱不對稱交錯(cuò)PCR和溫度遞降PCR。該些PCR變型針對不同用途提供廣泛類 型的用途。例如，可W通過等位基因特異性PCR鑒定單核巧酸多態(tài)性（SNP) 〇)NA中的單堿基 差異）、qPCR可W在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增的副本數(shù)目提供極高精度炬artlett等人，"A化ort HistoryofthePolymeraseChainReaction"，PCRProtocols, 2003)。
[0006] 最近，增加了高分辨烙解（HRM)法作為一種用于高通量突變掃描的新分子技術(shù) 狂hou，L.等人，Clin.Chern.51，1770-1777, 2005)。使用HRM確定突變基于與雙鏈DNA 相互作用的巧光染料存在下暴露于遞增溫度時(shí)DNA的解離（參見，例如US7, 387, 887 ; US7, 582, 429)。本領(lǐng)域中存在許多適宜的染料。突變的存在導(dǎo)致DNA異源雙鏈體形成，隨 后烙解行為改變。因此，該種"突變掃描"技術(shù)檢測祀基因衍生的PCR擴(kuò)增子中序列變異的 存在。在HRM實(shí)驗(yàn)中，首先在高分辨烙解染料存在下借助實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增樣品DNA。該類染料 的知名實(shí)例在W0 2008/052742中公開。在PCR后，后續(xù)烙解實(shí)驗(yàn)可W在同一個(gè)實(shí)時(shí)儀上進(jìn) 行，并用相應(yīng)的基因掃描軟件分析W鑒定序列變體。
[0007]經(jīng)典豬癌（CSF)，先前稱作豬霍亂，是一種侵襲家豬和野豬的高度接觸性和多系 統(tǒng)出血性疾病，它在全球養(yǎng)豬業(yè)中造成經(jīng)濟(jì)損失并且根據(jù)陸生動物衛(wèi)生法典，是世界動物 衛(wèi)生組織法定報(bào)告疾病（0IE，2007)。致病因子是經(jīng)典豬癌病毒（CSFV)，它是一種有囊膜、 正義、單鏈RNA病毒，歸屬于黃病毒科（Flaviviridae)的癌病毒屬（Pestivirus)。在遺傳 水平，基于E2基因和NS5B基因的部分序列，CSFV可W劃分成基因型1、2和3。每個(gè)基因 型可W劃分成亞基因型，分別稱作1. 1、1.2和1.3 ;2. 1、2. 2和2. 3 及3. 1、3. 2、3. 3和 3. 4(Paton等人，VetMicrobiol. 73:137-157, 2000)。在亞洲，CSF流行性是普遍存在的， 并且已經(jīng)在幾個(gè)亞洲國家分離基因型1、2和3。
[0008]CSFV可W引起急性、亞急性和慢性豬病，并且對全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大威脅，造成嚴(yán) 重經(jīng)濟(jì)損失。CSF的控制設(shè)及根除或接種，其中根除是在發(fā)達(dá)國家如歐盟巧U)的優(yōu)選控制 方法，因屠宰感染豬造成龐大數(shù)量的損失。在另一方面，接種是在發(fā)展中國家如中國的主要 控制策略。豬癌兔化病毒（肥LV)(也稱作C株）在二十世紀(jì)五十年代中期開發(fā)并且在中國 和許多國家廣泛使用（Moorman等人，JVirol. 70:763-770, 1996)。用肥LV疫苗大規(guī)模接 種造成在接種的豬群中難W區(qū)分CSFV的野生型株和肥LV株（VanOirshot,VetMicrobiol 96:367-384,2003)。CSFV亞臨床感染和無癥狀感染是普遍存在的（Moennig等人，Vet. J. 165, 11-20,2003 ;Tu，VirusRes. 81，29-37, 2001)，產(chǎn)生無法由農(nóng)民和獸醫(yī)師可容易識別 及無法通過一般檢測法如病毒分離、抗原捕獲化ISA和巧光抗體試驗(yàn)可檢出的野生型CSFV 感染。
[0009] 已經(jīng)開發(fā)各種診斷測定法。然而，它們?nèi)烤哂芯窒扌?。病毒分離需要6-12日 W證實(shí)結(jié)果；ELISA并不非常敏感并經(jīng)常產(chǎn)生假陰性結(jié)果；實(shí)時(shí)PCR測定法更快和更敏 感，但是受交叉污染高風(fēng)險(xiǎn)限制并且是最重要的。該些測定法均不能夠區(qū)分CSFV的野生 型毒株和疫苗毒株。之前，已經(jīng)在抓建立了區(qū)分野生型CSFV與"化ems"疫苗毒株的實(shí) 時(shí)RT-PCR測定法（Leifer等人，J.Virol.Methods158, 114-122, 2009;Leifer等人，J. Virol.Methods166, 98-100, 2010;Leifer等人，J.Gen.Virol. 91，2687-2697, 2010)，并且 在韓國開發(fā)了一種區(qū)分野生型CSFV和"K-LOM'疫苗毒株CSFV的測定法（化o等人，CanJ VetRes70:226-229,2006)。在中國，已經(jīng)描述了一種基于探針結(jié)合位點(diǎn)處核巧酸差異區(qū) 分野生型CSFV與肥LV-株疫苗的兩步驟實(shí)時(shí)RT-PCR測定法和一種使用小溝結(jié)合（MGB)探 針結(jié)合檢測野生型中突變的單步驟實(shí)時(shí)RT-PCR測定法（wt-rRT-PCR)。
[0010] 不太可能的是可在全部國家中使用一種通用檢測法，因?yàn)椴煌珻SFV疫苗株已經(jīng) 在不同國家施用，例如，在抓施用"Riems"，在韓國施用"K-L0M"，而在中國施用"肥LV"。因 此，需要開發(fā)一種實(shí)惠、易于執(zhí)行并易于解釋結(jié)果W區(qū)分經(jīng)典豬癌野生型和疫苗型的測定 法。
[0011] 傳染性支氣管炎（IB)是一種在全部國家養(yǎng)禽業(yè)流行的疾病，在大部分地區(qū)發(fā)生 率接近100%。它是經(jīng)濟(jì)上最重要的疾病。在維雞中，呼吸道疾病或腎炎導(dǎo)致死亡、增重 下降和加工時(shí)非難，而在產(chǎn)蛋期雞中，該種疾病為亞臨床的并導(dǎo)致產(chǎn)蛋量下降和異常蛋 (I即jatovic等人，ArchivesofVirology, 2006)。IB暴發(fā)持續(xù)在接種雞群中出現(xiàn)，主要地 因?yàn)檎J(rèn)為IB暴發(fā)由不同的IBV血清型、亞型或變體引起，所述血清型、亞型或變體因S1基 因的核巧酸點(diǎn)突變、插入、缺失或重組生成。
[0012] 致病因子，傳染性支氣管炎病毒（IBV)屬于冠狀病毒科（Coronaviridae)。它 是一種有囊膜正義單鏈RNA病毒，基因組長度27. 6化。前20化編碼病毒RNA依賴性 RNA聚合酶和蛋白酶。整個(gè)基因組從5'至3'具有至少10個(gè)可讀框（OR巧并如下： 5' -la-化-S(S1、S2)-3a、b、C巧)-M-5a、b-N-Poly(A)-3'，編碼 4 種結(jié)構(gòu)蛋白，包括纖突糖 蛋白做、膜糖蛋白（M)、磯酸化核衣殼蛋白㈱和小的膜蛋白似（Mardani等人，Arch Virol.155(10):1581-6, 2010)〇
[001引IBV于1930年首次在美國報(bào)道并且自此W后已經(jīng)在遍及W下四大洲的 大部分國家報(bào)道：美洲（Johnson和Marquar化,AvianDis. 19:82-90, 1975)、歐洲 (Capua等人，Zenha化 1Veterinarmed6.41:83-89, 1994 ;Cavana曲和Davis,Arch Virol130:471-476, 1993 ;Gou曲等人，VetRec. 130:493-494,1992)、亞洲（Wang 等人，AvianDis41:279-282, 1997)和大洋洲（I即jatovic和McWaters,JGen Virol. 72:2915-2922, 1991 ;Lo虹，AvianDis. 20:478-482, 1976)。在馬來西亞，關(guān)于本疾 病的流行率知之甚少。IB病的首次報(bào)道早至1967年，病情溫和并且接種無保障（化ong等人，SecondsymposiumonScientificandTechnologicalResearchinMalaysia andSingapore，第 73-83 頁，1967;Aziz等人,The8化VeterinaryAssociation MalaysiaScientificCongress, 23-25化August1996,Ipoh,第 76-78 頁）。變體已經(jīng) 自至少 1979 年起存在（Lohr,Proceedingsofthe1 曰tInternationalSymposiumon InfectiousBronchitis,EFKaleta&U.Heffels-Redmann(Eds),第 70-75 頁，1988 ; deWit等人，Avian化thology. 40(3) :223-235, 2011)，在 1980 年首次報(bào)告了 一個(gè)毒 力更強(qiáng)的毒株，所述毒株引起導(dǎo)致高死亡率的腎病-腎炎綜合征化eng等人，Kajian Veterinar. 12:1-8, 1980;Aziz1996)。與馬來西亞IBD相關(guān)的最近發(fā)表回溯至2000 年、2004年和2009年，自1995年起臨床報(bào)道了腎病變型變異IBV毒株（Maizan，2002 年 8 月 28 日-28 日，Proceeding12化FAVAand14化VAMcongress第 116 頁；Yap M.L等人，2000 年 9 月 1 日-4 日ProceedingVAMCongress;Arshad等人，J.Vet. Malaysia. 14Q&2): 322002;Ba化is等人，ProceedingsVAMCongress2004,Zulperi等 人，VirusGenes. 38:383-391,2009)。
[0014] 世界范圍內(nèi)，已經(jīng)鑒定出幾種不同的IBV血清型和基因型并且新變體仍然不斷 出現(xiàn)。該些新變體之一是QX樣IB。IB-QX已經(jīng)呈循環(huán)性并自2004起在中國報(bào)道（Liu 和Kong，Avianpathology，33:321-327,2004)。被鑒定為QX的病毒優(yōu)勢地與多種形 式的腎病變相關(guān)。其他研究者還已經(jīng)在中國報(bào)道了相似的毒株（Liu等人，JofGen Virol, 86:719-725, 2005)。在 2007 年，Cuiping等人（Vet.Microbio.，122:71，2007)證實(shí) 了Liu等人（2005)呈獻(xiàn)的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)報(bào)告在2003年和2005年之間從接種的雞群和未 接種的雞群分離腎型毒株。相似的研究結(jié)果也已經(jīng)在俄羅斯和歐洲其他地區(qū)報(bào)道炬ochkov 等人，AvianPathology, 35:379-393, 2006 ;Landman等人，Proceedingsofthe14thWorld Veterinary化ultryCongress, 22-26August, 2005,Istanbul, "Turkey,第 369 頁）。
[0015] 不太可能的是可在全部國家中使用一種通用檢測法，因?yàn)樵诓煌瑖沂┯昧瞬煌?的IBV疫苗株。因此，需要開發(fā)一種實(shí)惠、易于執(zhí)行并易于解釋結(jié)果W區(qū)分傳染性支氣管炎 (IB)野生型和疫苗型的測定法。
[0016] 盡管采用密集接種計(jì)劃，新城疫病毒（NDV)仍總是威脅全球商業(yè)養(yǎng)禽場。NDV是單 分子負(fù)鏈RNA病毒目（Mononegavirales)、副粘病毒科（Paramyxoviridae)和禽腮腺炎病毒 屬（Avulavirus)的成員。它是一種包膜病毒，具有由15, 586個(gè)核巧酸組成的負(fù)義、不分節(jié) 段單鏈RNA基因組。其基因組由六個(gè)基因組成；核蛋白（NP)、磯蛋白（P)、基質(zhì)蛋白（M)、融 合糖蛋白（巧、血凝素-神經(jīng)氨酸酶化腳、糖蛋白和大聚合酶蛋白（L)。NDV中存在的六個(gè) 基因當(dāng)中，其兩種膜蛋白即F蛋白和HN蛋白在決定其毒力方面最重要。
[0017] 近年來實(shí)時(shí)PCR方法的建立已經(jīng)導(dǎo)致多種傳染介質(zhì)的分子診斷學(xué)取得明顯進(jìn)展， 并且已經(jīng)快速削減為現(xiàn)場獸醫(yī)師和農(nóng)民提供快速和精確結(jié)果的疾病診斷結(jié)果周轉(zhuǎn)時(shí)間。已 經(jīng)針對使用幾種不同化qMan探針或SYBR綠進(jìn)行NDV檢測和基因型區(qū)分的實(shí)時(shí)PCR分析描 述了許多PCR測定法（Wise等人，J.ClinMicrobiol, 42:329-338, 2004)sTan等人（J.Virol Method, 160:149-156, 2009)描述了用于檢測和區(qū)分NDV基因型的SYBR綠I實(shí)時(shí)PCR,然而 該種測定法需要不同引物對用于檢測不同NDV基因型并且嚴(yán)重依賴分析烙解峰來區(qū)分S 個(gè)NDV基因型。盡管SYBR綠1測定法是與其他實(shí)時(shí)檢測樣式相比，建立實(shí)時(shí)PCR的成本最有 效和最容易形式，然而，主要缺點(diǎn)是染料分子結(jié)合于反應(yīng)混合物中存在的任何雙鏈DM(包 括非特異性PCR產(chǎn)物或引物-二聚體）。因此，存在改善當(dāng)前分子診斷方法W提供快速和結(jié) 論性NDV檢驗(yàn)結(jié)果的空間。
[001引發(fā)巧簡巧
[0019] 本發(fā)明設(shè)及一種表征IBV、CSFV或NDV的方法或過程，所述方法或過程包括步驟： a)從病毒株產(chǎn)生cDNA;b)在實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)中使所述cDNA暴露于包含正向引物 和反向引物的引物對W產(chǎn)生擴(kuò)增子，其中所述引物對是對病毒基因組的某個(gè)基因或區(qū)域特 異的；C)在實(shí)時(shí)PCR后立即對包含擴(kuò)增子的雙鏈產(chǎn)物進(jìn)行高分辨烙解（HRM)曲線分析；和 d)分析并比較HRM曲線，從而表征病毒株。IBV的基因可W是S1基因。NDV的基因可W是 尸、^、口、]?、歴或1基因?！?。￥的區(qū)域可^是四種結(jié)構(gòu)性佑、61113、61和￡2)或8種非結(jié)構(gòu) 性蛋白（化ro、P7、NS2、NS3、NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)區(qū)域。
[0020] 本發(fā)明還提供隨該類方法使用的底物和試劑盒。
[00川 附圖簡巧
[0022] W下詳細(xì)描述可W結(jié)合附圖最好地理解，所述詳細(xì)描述W舉例方式給出，但不意 在將本發(fā)明唯一地限于所述的具體實(shí)施例，其中：
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