鑒別布魯氏菌s2疫苗株與野毒株的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種鑒別布魯氏菌S2疫苗株與野毒株的試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌病度rucellosis)是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的一種廣泛分布于世界各 地的人畜（獸）共患傳染病，其不僅影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展而且危害人類公共衛(wèi)生健康。 根據(jù)國家衛(wèi)計委公布的全國法定傳染病疫情數(shù)據(jù)，2014年我國人感染布魯氏菌病人數(shù)為 57222,發(fā)病率比2013年增長了 31. 48%。人感染布魯氏菌病的傳染源主要來源于感染的動 物及被污染的畜產(chǎn)品，因此，控制和消滅動物布魯氏菌病，是防止人類感染布魯氏病的根本 保障。
[0003] 目前疫苗免疫仍是控制動物布魯氏菌病的主要措施之一。當(dāng)前國外主要使用的布 魯氏菌疫苗株是牛種S19株和RB51株W及羊種Rev. 1株，運些疫苗株我國目前尚未引進(jìn)和 使用。我國使用的疫苗株主要是牛種布魯氏菌A19疫苗株和豬種布魯氏菌S2疫苗株，W前 還曾使用過羊種M5-90疫苗株，由于毒力問題現(xiàn)在暫時不再使用。S2疫苗株的使用為我國 動物群布魯氏菌病的防控提供了重要保障，該疫苗毒力比S19和Rev. 1弱，對豬、牛、羊均能 產(chǎn)生良好的免疫，其突出的優(yōu)點還在于通過口服方式免疫懷孕母畜不會引起流產(chǎn)。但是也 存在著無法鑒別疫苗株與野毒感染株的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸問題。雖然競爭化ISA(cELISA)和巧 光偏振實驗（FPT) W其高通量W及操作方面的優(yōu)勢，在布魯氏菌弱毒疫苗與野生菌株感染 的血清學(xué)鑒別有一定的應(yīng)用，但是對未知背景的血清樣本來說，單次檢測仍不能確切分辨 疫苗免疫或野毒感染。從病原學(xué)方面鑒別診斷布魯氏菌野毒株核酸，可W準(zhǔn)確判斷動物體 是否帶菌，為布魯氏菌病陽性動物的檢疫淘汰提供支撐。因此，利用分子生物學(xué)方法，依據(jù) S2疫苗株與其他布魯氏菌毒株基因組差異堿基序列，通過PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物序列測定，可 有效實現(xiàn)S2疫苗株與野毒株的分子鑒別，將其應(yīng)用于臨床鑒別，可W為我國S2疫苗株的鑒 別提供技術(shù)保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人通過基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)與其他布魯氏菌屬細(xì)菌基因組相比，豬種布魯 氏菌S2疫苗株在基因組246967位點處，即SEQ ID No. 3的369位點處缺失25個核巧酸序 列燈CCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)，根據(jù)該缺失序列，本發(fā)明設(shè)計擴(kuò)增引物，通過序列比對 與峰圖中是否出現(xiàn)套峰就可W將其與其他布魯氏菌野毒株或疫苗株進(jìn)行鑒別，W上是提出 本發(fā)明的技術(shù)依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒別布魯氏菌S2疫苗株與野毒株的試劑盒及其使用方 法，該試劑盒能夠特異地鑒別臨床樣本中布魯氏菌S2疫苗株。
[0006] 為實現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案：
[0007] 鑒別布魯氏菌S2疫苗株的試劑盒，該PCR試劑盒由PCR反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；
[0008] 所述PCR反應(yīng)液包括鑒定并測序S2疫苗株特異性核巧酸序列的引物對，其中鑒別 S2疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示。分別 如下：
[0009]沈Q IDNo.1 :5'-CCTGCTGAGCGATGACCACCA-3'
[0010]沈Q IDNo.2 :5' -CCGCCAGAACATGCGATTTGA-3'
[0011] 所述陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為豬種布魯氏菌S2疫苗株陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；
[0012] 所述豬種布魯氏菌S2疫苗株陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品由含有539個堿基的核巧酸片段構(gòu) 成的祀ASY-T3重組質(zhì)粒組成。
[0013] 所述含有539個堿基的核巧酸片段的序列如SEQIDNo. 3 :
[0014] SEQIDNo. 3：
[0016] 所述PCR反應(yīng)液還包括含有dNTPs、1護(hù)、雙蒸水的PCR緩沖液。
[0017] 所述含有539個堿基的核巧酸片段是從豬種布魯氏菌S2疫苗株中克隆得到。
[0018] 所述陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水（d地2〇)。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒別布魯氏菌S2疫苗株的PCR試劑盒的使用方法，該方法的 條件和步驟如下：
[0020] (1)提取待測樣本的基因組DNA ;
[0021] 所述待檢測的樣本為血液、奶樣、組織樣本、氣溶膠樣本等。
[0022] (2) W提取的樣本基因組DNA為模板，將樣本DNA、陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控標(biāo) 準(zhǔn)品分別加入到含有PCR反應(yīng)液和DNA聚合酶的50 y L體系的PCR反應(yīng)管中，按照經(jīng)過 優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，具體的反應(yīng)條件為：94°C 3min，94°C 30sec、60°C 30sec、 72°C 30sec，35 個循環(huán)，72°C lOmin;
[0023] 所述PCR反應(yīng)液由鑒定S2疫苗株的引物對W及含有(1饑？3、1護(hù)、雙蒸水的PCR緩 沖液組成；
[0024] 所述引物對分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,分別命名為S2-F和S2-R，序列 如下： 陽0巧]正向引物S2-F :5' -CCTGCTGAGCGATGACCACCA-3'
[0026]反向引物S2-R :5' -CCGCCAGAACATGCGATTTGA-3'
[0027] 所述的PCR反應(yīng)體系為50 y L具體包括W下組份：
[0028]
[0029] (3)取50yL PCR產(chǎn)物，W 1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察鑒別豬種布魯氏 菌S2疫苗株引物對擴(kuò)增出539bp及與之大小對應(yīng)的條帶；本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，在瓊脂 糖凝膠電泳檢測時，顯示與目的條帶大小對應(yīng)的條帶，意指PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相近，因樣品 來源或目標(biāo)種屬不同，PCR產(chǎn)物大小會有較小差異，但顯示條帶對應(yīng)，例如相差30bp/2化P 范圍內(nèi)的條帶均顯示大小對應(yīng)。
[0030] (4)如果上述PCR檢測結(jié)果與目的條帶不符，則說明模板為布魯氏菌陰性，如果 PCR檢測條帶大小正確，則對陽性條帶進(jìn)行切膠回收純化，然后再進(jìn)行序列測定。
[0031] (5)鑒別布魯氏菌S2疫苗株的結(jié)果判定：使用S2-F引物對純化的539bp及與之 大小對應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行測序，如果測序結(jié)果峰圖為單一峰，與SEQIDNo. 3比對后完全匹配，貝U 該樣本為S2疫苗株；如果測序結(jié)果峰圖為單一峰，與SEQIDNo. 3比對后在第369位點處多 出25個核巧酸序列燈CCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)，則該樣本為除S2疫苗株W外的其他布 魯氏菌野毒株或疫苗株；如果測序結(jié)果與SEQIDNo. 3比對，在峰圖序列第369位點后出現(xiàn)套 峰，則該樣本為S2疫苗株和其他布魯氏菌株混合。
[0032] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，上述鑒別方法，其直接目的是鑒別菌株種類，而非獲取 疾病診斷結(jié)果。
[0033] 本發(fā)明取得了 W下效果：
[0034] (1)為我國S2疫苗株的鑒別提供新的技術(shù)手段；
[00對 似本發(fā)明所述引物對具有較高的特異性，通過擴(kuò)增-電泳檢測，可有效的區(qū)分布 魯氏菌和其他常規(guī)細(xì)菌菌株；
[0036] (3)本發(fā)明所述鑒別方法，有效地將其他布魯氏菌野毒株與S2疫苗株區(qū)分開來， 具有極高的準(zhǔn)確率。
【附圖說明】
[0037] 圖1 S2疫苗株缺失位點處上下游序列PCR擴(kuò)增，+ :模板為S2疫苗株陽性質(zhì)控標(biāo) 準(zhǔn)品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物539bp，-:模板為陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，1-5:模板分別為豬種布魯氏菌疫 苗株S2株、牛種布魯氏菌疫苗株A19株、羊種布魯氏菌疫苗株M5-90株、綿羊種布魯氏菌 63/290株、犬布魯氏菌RM6/66株基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物539bp ;6-10 :模板分別為大 腸桿菌〇157:H7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌0:9、沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、牛分支桿菌基因組 DNA。 陽03引圖2 S2疫苗株缺失位點處序列測定峰圖，A :測序峰圖為單一峰，與沈QIDNo. 3比 對后完全匹配，檢測模板為S2疫苗株。B :測序峰圖為單一峰，與SEQ ID No. 3比對后在369 處多出25個核巧酸序列燈CCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)，檢測模板為除S2疫苗株W外的其 他布魯氏菌野毒株或疫苗株。C :測序結(jié)果與SEQ ID No. 3比對，峰圖在序列位點369 W后 出現(xiàn)套峰，檢測模板為S2疫苗株與其他布魯氏菌株的混合。
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0040] W下實施例均按照常規(guī)試驗條件與方法進(jìn)行，或者按照制造廠商所建議的試驗條 件。
[0041] 1.試驗材料
[0042] 豬種布魯氏菌疫苗株S2株度.suis S2)，牛種布魯氏菌疫苗株A19株化油ortus A19)，羊種布魯氏菌疫苗株M5-90株度.melitensis M5-90)，綿羊種布魯氏菌63/290株 度.ovis 63/290)，犬布魯氏菌RM6/66株度.canis RM6/66)，大腸桿菌0157:H7、小腸結(jié) 腸炎耶爾森菌0:9、沙口氏菌、金黃色葡萄球菌（CMCC25623)、牛分支桿菌（M. bovis ATCC 19210)、臨床上確診為布魯氏菌陽性的血液、奶樣、流產(chǎn)胎兒組織和氣溶膠等DM樣本均由 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中屯、疾病研究室保存。 陽0創(chuàng) DNA聚合酶燈aKaRa LA化q)購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖購自北京 全式金生物技術(shù)有限公司，快速DNA提取試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試 劑盒等均購自天根生化科技（北京）有限公司，其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。 PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA序列測定由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測 序中屯、完成。 W44] 2.實驗儀器
[0045] 梯度PCR儀燈aKaRa TP-600)，電