檢測(cè)hbv病毒擴(kuò)增的引物組和熒光探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及檢測(cè)皿V病毒擴(kuò)增的引物組和巧光探針 及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒化BV)感染引起的一種疾病，主要通過(guò)血和血制品、 母嬰傳播及性接觸傳播。乙型肝炎病毒感染者臨床表現(xiàn)多樣化，潛伏期較長(zhǎng)，最常見(jiàn)的臨床 表現(xiàn)有食欲減退、惡屯、、嘔吐、腹脹、乏力等癥狀，部分患者有低熱等癥狀。乙型肝炎患者可 發(fā)展為慢性肝炎，導(dǎo)致肝硬化或肝癌。
[0003] 皿V-DNA常規(guī)檢測(cè)方法主要有斑點(diǎn)雜交法和巧光定量PCR法。斑點(diǎn)雜交法是較傳 統(tǒng)的方法，成本較低，靈敏度W及精準(zhǔn)度都較低，假陽(yáng)性幾率較高，不適合做皿V定量檢測(cè)。
[0004] 巧光定量PCR法是一種集PCR技術(shù)、巧光信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析于一體的核酸定量 檢測(cè)技術(shù)。巧光定量PCR使用了特異性的探針，能夠?qū)胄蛄羞M(jìn)行特異性的識(shí)別，具有引物 探針雙重控制，且綜合了巧光標(biāo)記技術(shù)、激光檢測(cè)技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)，在擴(kuò)增指數(shù)期進(jìn)行 定量，具有很高的特異性、靈敏性，準(zhǔn)確性及假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)。 陽(yáng)00引國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用皿V-DNA巧光定量PCR法存在W下缺陷：
[0006] 1.常用的核酸提取方法有：a、磁珠法；b、層析柱法；C、堿裂解法。^上；種方法需 要繁瑣的離屯、、換管等步驟，易導(dǎo)致核酸污染與丟失，且操作過(guò)程繁雜，操作人員易疲勞操 作。
[0007] 2.定量標(biāo)準(zhǔn)品操作：大多標(biāo)準(zhǔn)品由于不參與核酸提取，不能全面真實(shí)反映核酸提 取和擴(kuò)增。
[0008] 3. PCR反應(yīng)體系：傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)體系多為無(wú)色，容易導(dǎo)致視覺(jué)疲勞。
[0009]有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的有；個(gè)：提供一種檢測(cè)皿V病毒擴(kuò)增的引物組和巧光探針；提供一 種檢測(cè)皿V病毒的試劑盒；提供一種檢測(cè)皿V病毒的方法。
[0011] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用技術(shù)方案的基本構(gòu)思是：
[0012]檢測(cè)皿V病毒擴(kuò)增的引物組和巧光探針，包括
[0013] 上游引物皿V-F:如沈Q ID NO: 1所示的核巧酸序列；
[0014] 下游引物HBV-R :如SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列；
[0015]化qman巧光探針皿V-FP:如SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列，在5'端標(biāo)記巧光報(bào) 告基團(tuán)，除5'端標(biāo)記巧光澤滅基團(tuán)。
[0016]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，在3'端標(biāo)記有澤滅基團(tuán)；
[0017]本發(fā)明在PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的巧光探針，該探針 為一寡核巧酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告巧光基團(tuán)和一個(gè)澤滅巧光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基 團(tuán)發(fā)射的巧光信號(hào)被澤滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降 解，使報(bào)告巧光基團(tuán)和澤滅巧光基團(tuán)分離，從而巧光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到巧光信號(hào)，即每擴(kuò)增 一條DNA鏈，就有一個(gè)巧光分子形成，實(shí)現(xiàn)了巧光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 [001引作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述巧光報(bào)告基團(tuán)為6-簇基巧光素化-FAM);
[0019] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述巧光澤滅基團(tuán)為黑桐澤滅劑1度冊(cè)1);
[0020] 所述巧光報(bào)告基團(tuán)和巧光澤滅基團(tuán)均為市售。
[0021] 本發(fā)明所述的試劑盒包括上述所述的引物組和巧光探針，W及促巧光劑；
[0022] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，還包括皿V病毒定量標(biāo)準(zhǔn)品I~IV組、陰性質(zhì)控品 和皿V臨界陽(yáng)性質(zhì)控品。
[0023] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述陰性質(zhì)控品為滅活皿V陰性血清；所述皿V臨界 陽(yáng)性質(zhì)控品為濃度介于1. 0X 102~2. 0X 10 3IU/mL的皿V陽(yáng)性血清；所述皿V病毒定量標(biāo) 準(zhǔn)品I濃度為2. 0 X l〇3lU/mL、皿V病毒定量標(biāo)準(zhǔn)品II濃度為1. 0 X l〇5lU/mL、皿V病毒定量 標(biāo)準(zhǔn)品III濃度為5. 0X 106IU/mL、皿V病毒定量標(biāo)準(zhǔn)品IV濃度為2. 5X 108IU/mL。
[0024] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述促巧光劑是終質(zhì)量百分濃度為0. 01%的孔雀石 綠水溶液。
[00巧]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，還包括酶混合物。 陽(yáng)0%] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述酶混合物為化q DNA酶和UNG酶。
[0027] 上述試劑盒的使用方法，包括如下步驟： 陽(yáng)0測(cè) 1)提取核酸DNA ;
[0029] 2)采用W上任意所述的試劑盒進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增時(shí)化q DNA 酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使巧光報(bào)告基團(tuán)和澤滅基團(tuán)分離，從而巧光監(jiān)測(cè)系 統(tǒng)可接收到巧光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)巧光分子形成，實(shí)現(xiàn)了巧光信號(hào)的累 積與PCR產(chǎn)物形成完全同步；
[0030] PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括：PCR反應(yīng)液30 y L酶混合物1. 5 y L促巧光劑1. 5 y L所述 PCR 反應(yīng)液的組成為：皿V-F (10 y M) 1. 5 y L，皿V-R (10 y M) 1. 5 y L，皿V-P (10 y M) 0. 4 y L， DNA Mix 19. 5 yL最后用無(wú)菌超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至30 yL。
[0031] 3)通過(guò)巧光定量PCR儀檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，巧光信號(hào)收集時(shí)設(shè)定為60°C、FAM巧光 素，如果檢測(cè)通道沒(méi)有出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，判為皿V病毒陰性；如果檢測(cè)通道出現(xiàn)S型擴(kuò)增 曲線，則判定為陽(yáng)性，并利用皿V定量標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度 師/血）。
[0032] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述步驟2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：37°C條件下反應(yīng) 2分鐘；95°C，3分鐘；然后，95°C，10秒，60°C，35秒，共45個(gè)循環(huán)。
[0033] 采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下有益效果：
[0034] 1)利用本發(fā)明的試劑盒可W快速、簡(jiǎn)便的對(duì)皿V病毒相關(guān)性肝炎進(jìn)行篩查； 陽(yáng)03引。本發(fā)明的檢測(cè)方法敏感性高，最低檢出可達(dá)到500IU/mL ;
[0036] 3)本發(fā)明的檢測(cè)方法的特異性很好，不和其他的病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，例如JC病毒 (JCV)，丙肝病毒（HCV)，邸病毒巧BV)，人巨細(xì)胞病毒（HCMV)，人類細(xì)小病毒B19 (HPV B19) 和服病毒度KV)等；
[0037]4)本發(fā)明的檢測(cè)方法反應(yīng)快速，一般1. 5到2小時(shí)即可得到反應(yīng)結(jié)果；
[0038]5)本發(fā)明的檢測(cè)方法成本低、無(wú)假陽(yáng)性，適合于大規(guī)模臨床開(kāi)展，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)皿V 病毒的快速、有效且準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，因而能保證及時(shí)的病例診治及治療效果監(jiān)測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1為采用巧光定量PCR儀檢測(cè)待測(cè)樣本得到的曲線； W40]圖2為采用巧光定量PCR儀檢測(cè)皿V病毒定量標(biāo)準(zhǔn)品得到的曲線；
[0041] 圖3為采用巧光定量PCR儀通過(guò)皿V病毒定量標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)皿V陽(yáng)性樣本進(jìn)行定量得 到的曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0042] W下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋說(shuō)明。
[0043] 1、對(duì)本發(fā)明中用到的試劑進(jìn)行一下解釋： W44] 1)核酸釋放劑：
[0045]核酸釋放劑紫紅色，具體組成成分為0.0015%的孔雀石綠、0.015%的明膠、 Tris-肥1、0.01% TritonX-100、5. Omg/L蛋白酶K、0.5M化0H，分裝量為leOyLXl管/48 份；
[0046]2) PCR反應(yīng)液：
[0047] PCR反應(yīng)液具體組成成分為：皿V-F(10y M)1.5y L皿￥-3(10y M)1.5y L 皿V-FP(10yM)0.4yL DM Mix19.5^以水7.1^以分裝量為1500yLXl管/48份；
[0048]扣hq DM酶/UNG酶：80y L X1管/48份； W例4)促巧光劑：
[0050] 促巧光劑具體組成成分為1.5y L水、終質(zhì)量百分濃度0.01%的孔雀石綠，呈淺藍(lán) 色，分裝量為SOiiLXl管/48份；
[(K)川 f5)定量標(biāo)準(zhǔn)品：HBV定量標(biāo)準(zhǔn)品I (2.0X103IU/血)、皿V定量標(biāo)準(zhǔn)品 II (1.0X l05lU/mL)、皿V定量標(biāo)準(zhǔn)品III巧.0X l06lU/mL)、皿V定量標(biāo)準(zhǔn)品IV (2.5X l0SlU/血)、皿V陰性質(zhì)控品、皿V臨界陽(yáng)性質(zhì)控品各30y L。 陽(yáng)化引2、皿V標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)控品的制備如下： W53] 收集皿V DNA強(qiáng)陽(yáng)性混合滅活血清，使用已滅活陰性血清進(jìn)行稀釋，制備 2.5Xl〇SlU/mL5. OXl〇6lU/mLl. OXl〇5lU/mL2. OXl〇3lU/ml皿V標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)控品，采用 衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品血清（國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)），進(jìn)行10X10實(shí)驗(yàn)內(nèi)及實(shí)驗(yàn)間重復(fù)，最終確定皿V 標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)控品的DNA含量，并進(jìn)行保存條件的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。實(shí)現(xiàn)原病毒血清質(zhì)控品與標(biāo) 本同時(shí)進(jìn)行核酸提取與擴(kuò)增的全程監(jiān)控。
[0054]3、皿￥0臟提取 陽(yáng)化5] 取3y L核酸釋放劑，加入PCR反應(yīng)管中，取待測(cè)血清各3y L加入對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng) 管中，并用移液器在管底吹打混勻15~20次，各PCR反應(yīng)管中分別加入30y L無(wú)菌石蠟油， 然后在PCR反應(yīng)管口貼上封口膜；將PCR反應(yīng)管放置在巧光定量PCR儀中進(jìn)行95°C，lOmin 高溫裂解反應(yīng)。將經(jīng)過(guò)裂解處理后的PCR反應(yīng)管從巧光定量PCR儀中取出，撕棄封口膜，懸 空加入PCR-mix (PCR反應(yīng)液、酶混合物、促巧光劑），瞬時(shí)離屯、，備用。
[0056] 4、PCR反應(yīng)液的配制與加樣
[0057] 按W下比例進(jìn)行PCR反應(yīng)液配制與加樣：PCR反應(yīng)液30 y LX (n+4管定量標(biāo)準(zhǔn)品 和一管陰性對(duì)照W及一管臨界陽(yáng)性質(zhì)控品），每管加化q DM酶/UNG酶1. 5 y ^促巧光劑 1. 5 y L ;震蕩混勻，每份33 y L加入皿V DNA提取管中，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0058] 5、PCR擴(kuò)增條件
[0059] 37°C，2 分鐘；95°C，3 分鐘；（95°C，10 秒；60°C，35 秒）X 45 個(gè)循環(huán)；25°C，30 秒
[0060] 采用MX3000P巧光定量PCR儀，巧光信號(hào)收集時(shí)設(shè)定為FAM巧光素，巧光信號(hào)收集 設(shè)在60°C。 陽(yáng)OW] 6、結(jié)果判讀
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