一種水稻溫敏不育基因tms5的功能標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水稻分子檢測領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明公開了針對tm巧功能突變位點 設(shè)計的的功能標(biāo)記，該功能標(biāo)記可用檢測水稻樣品中是否含有tm巧基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻兩系不育資源的發(fā)現(xiàn)及成功應(yīng)用，為保障我國糧食安全發(fā)揮了重要作用。與 =系不育系相比，兩系雜交水稻不受恢復(fù)基因的限制，配組自由，資源利用率高，使得兩系 雜交水稻在產(chǎn)量和米質(zhì)方面均較=系雜交水稻有較大提升。同時，兩系不育系還具有能自 我繁殖的優(yōu)點。因此，近年兩系法雜交水稻在我國發(fā)展速度快，種植面積和推廣范圍迅速擴(kuò) 大。
[0003] 選育優(yōu)良的兩系不育系，是培育兩系雜交水稻的重要前提。傳統(tǒng)的兩系不育系選 育需要在海南和內(nèi)地穿梭育種，利用海南冬季的低溫短日照繁殖不育株，內(nèi)地夏季的高溫 長日照鑒定育性。運種選育方式，具有諸多限制因素。因此，開發(fā)兩系不育基因的分子標(biāo)記， 應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇，將能大大提高不育系的選育效率。其次，由于兩系雜交稻種子的價格 和銷售利潤都明顯高于其他水稻種子，使得種子假冒事件時有發(fā)生，嚴(yán)重擾亂了種子市場， 給農(nóng)民造成重大經(jīng)濟(jì)損失。另外，由于兩系雜交水稻制種過程中，易受溫、光條件的影響， 使不育系自交結(jié)實，導(dǎo)致純度降低，我國規(guī)定雜交稻的純度需>96%，而傳統(tǒng)的種植鑒定費 時、費工、結(jié)果滯后。還有，水稻兩系不育系最早在我國境內(nèi)發(fā)現(xiàn)，為我國的特有種質(zhì)資源， 且為我國的糧食安全作出重大貢獻(xiàn)。國務(wù)院多次強(qiáng)調(diào)要堅決遏制我國特有種質(zhì)資源向國外 流失。但是，缺少有效的檢測手段防止外流。
[0004] 因此，根據(jù)不育基因的DNA序列信息，設(shè)計共顯性的分子標(biāo)記，特異性地將含有不 育基因和不含有不育基因的水稻材料區(qū)分開，將對兩系不育系的分子標(biāo)記輔助選擇、種子 市場的套牌打假、純度鑒定和種質(zhì)資源流失管控都具有重要意義。
[0005] 目前，生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的兩系按其不育基因來源可分為兩類。一類來源于 農(nóng)星58S，一般被稱為含有光敏不育基因（PGM巧的不育系，生產(chǎn)上使用的代表不育系如 培矮64S，7001S。2012年，Ding等和Zhou等分別克隆pms3 (或P/TMS12-1)基因（參 見，A long noncoding 民NA regulates photoperiod-sensitive male sterility,an essential component of hybrid rice, PNAS, 2012, 109:2654 - 2659 和 Photoperiod-and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA, Cell 民esearch, 2012:1-12.)，農(nóng)呈 58s中的pms3基因一個堿基G突變?yōu)镃，導(dǎo)致RNA結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生不育。
[0006] 另一類來源于安農(nóng)S-1，常被稱為溫敏不育基因（TGMS，tms5, ptgms2-l)，代表 的不育系有廣占 63s、ZhulS 等。2011 年，Xu 等的文章[Fine mapping and candidate gene analysis of ptgms2-l，the photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile gene in rice(0ryza sativa lOfllieor Appl Genet. 2011，122(2) :365-372]中介紹了 將其定位在第二染色體的兩個Indel標(biāo)記間，距離50. 4肺，該區(qū)間有10個基因，其中一個 核糖核酸酶z基因被認(rèn)為是tm巧的候選基因（L0C_0s02gl2290)，在廣占63s中，距離起 始密碼子7化P的C突變?yōu)锳，導(dǎo)致密碼由TCG變?yōu)榻K止密碼子TAG,推測可能是tm巧的 突變位點'〇 2014 年，Zh曰n邑等[Ch曰r曰cteriz曰tion of 曰n RN曰se Z nonsense mut曰tion identified exclusively in environment-conditioned genic male sterile rice, Mol 化eeding(2014) 34:481 - 489]，對多份兩系不育系進(jìn)行了等位型測驗和測序分析，發(fā)現(xiàn)先 前報道的tms5、tms9和ptgms2-l為等位基因，且溫敏不育系具有共同的序列特征，即在距 離起始密碼子70-7化P位置均為TA，而非溫敏不育系材料為GC或TC。同年，Zhou等[RNase ZSiprocesses UbL40mRNAs and controls thermosensitive genic male sterility in rice, NATURE COMMUNICATIONS, DOI: 10. 1038/ncomm巧884]功能互補(bǔ)驗證試驗結(jié)果顯示： 70-7化P位置為GC(日本晴）和TC(安農(nóng)腳型的Tm巧基因均能使安農(nóng)S-1 UA型）恢復(fù) 育性，說明71位C 一 A的突變是導(dǎo)致安農(nóng)S-1花粉在高溫條件下不育的功能型突變位點。 Tm巧編碼產(chǎn)物為RNase ZSi，RNaseZsi可W降解UbL40的mRNA，在tm巧突變體中RNaseZsi 酶失活，無法降解UbL40的mRNA，導(dǎo)致UbL40的mRNA積累，高溫條件下，UbL40表達(dá)量高， 導(dǎo)致不育系不育，低溫條件下化L40表達(dá)量低，導(dǎo)致可育。文中還根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部的統(tǒng)計數(shù) 據(jù)，分析了我國推廣的兩系雜交水稻，發(fā)現(xiàn)我國的兩系不育系有71%含有tm巧基因，且運 些不育系配組的雜交稻推廣面積占整個兩系雜交稻推廣面積的83. 8% (約290萬公頃）， 運說明當(dāng)前兩系雜交水稻生產(chǎn)上，tm巧較pms3應(yīng)用更廣泛。
[0007] pms3和tm巧的定位、克隆和序列分析工作為設(shè)計pms3和tm巧的分子標(biāo)記奠定了 基礎(chǔ)。對于pms3基因，由于與本發(fā)明所要標(biāo)記的基因不同，運里不做詳細(xì)介紹。
[0008] 對于tm巧基因，2011年楊劍波等[一個與水稻溫敏不育基因tm巧緊密連鎖標(biāo)記 的開發(fā)與應(yīng)用，專利號：zl 20011 1 0326770. 1]開發(fā)了一個用于tm巧檢測的Indel標(biāo)記 SJ00USJ001-F :5' ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3'，SJ001-R :5' GGCCAAGTGTTATGATCACT 3')， 專利中稱：用PCR擴(kuò)增該標(biāo)記位點，攜有tm巧基因的溫敏核不育系僅擴(kuò)增出一條38化P的 譜帶；攜有tm巧基因的溫敏型兩系雜交水稻會擴(kuò)增出大小分別為463bp和387bp的兩條譜 帶；不攜有tm巧基因的水稻（非溫敏型水稻）僅擴(kuò)增出一條463bp的譜帶。2012年，出入 境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《兩系水稻品種真實性與純度鑒定DNA分析法》（SN/T 3402-2012)中 設(shè)計了 Indel標(biāo)記tm巧-S2用于檢測tm巧基因，盡管SJ001標(biāo)記和tm巧-S2標(biāo)記的引物序 列不同，但是擴(kuò)增的多態(tài)位點是一致的，均為tm巧基因起始密碼子ATG上游約5肺位置的 78bp缺失位點。應(yīng)用SJ001和tm巧-S2過程中，我們發(fā)現(xiàn)部分非兩系不育系如協(xié)青早A中 也能擴(kuò)增出陽性條帶。導(dǎo)致運種假陽性結(jié)果的原因是運兩種標(biāo)記檢測的位點不是導(dǎo)致tm巧 功能缺失的突變位點（后稱功能位點）。
[0009] 2011年，曹曉風(fēng)等在申請?zhí)枮?01110292922.0的專利申請"一種快速便捷 檢測水稻溫敏不育系的方法"中設(shè)計了兩對引物（RMZ-11F :CCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R:CACTCGGAGGTCTACAATCT ;RMZ-13F:GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和 RMZ-13R:GCGATGACTTGCCGCTGT)用于檢測溫敏不育基因，并認(rèn)為電泳結(jié)果中比野生型產(chǎn)物 電泳速度快的為攜帶不育基因的溫敏不育系；運兩對引物均是檢測tm巧基因ATG上游-1 至-6位6堿基的缺失。即該標(biāo)記檢測的也不是tm巧的功能突變位點，仍然存在檢測假陽 性風(fēng)險。根據(jù)Zhang等[Mol化eeding(2014)34:481 - 489]對多個品種（品系）的tm巧 基因測序結(jié)果，可W發(fā)現(xiàn)，用RMZ-11和RMZ-13標(biāo)記檢測tm巧基因，會在不含有tm巧基因 的材料如 08EZ01, Hua201, Hua966, L718, R287, R288, Yi R88, W6154, Zaoxian2430 中出現(xiàn)假 陽性結(jié)果。
[0010] 2014 年，Zhang 等[參見，Mol deeding (2014) 34:481 - 489]開發(fā) 了針對 tm巧 功能突變位點的兩個 dCAPS 標(biāo)記 RZ2F1/R 和 RZ2F2/R(RZ2F1 :ACCGCGCCGCCACCGGGTCGG CCCAAG，RZ2F2 :ACCGCGCCGCCACC GGGTCGGCCGGAG，RZ2R :TGAAGAGGAA CTCCTGCGAGACGG)。 RZ2F1/R和RZ2F2/R的擴(kuò)增產(chǎn)物均為178bp，但是RZ2F1/R產(chǎn)物中引入了 Sty I酶切位點， 能切開70-72bp位置為GCG的擴(kuò)增產(chǎn)物（153bp和25bp)，而切不開tm巧基因（70-72bp為 TAG)的擴(kuò)增產(chǎn)物，RZ2F2/R產(chǎn)物中引入了化nf I酶切位點，能切開70-72bp位置為TCG的 擴(kuò)增產(chǎn)物，同樣無法切開tm巧基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。運種設(shè)計通過兩次擴(kuò)增、兩次酶切，根據(jù)酶 切結(jié)果推斷