抑制STAT3表達和防治慢性移植物抗宿主病的shRNA及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種shRNA，特別設(shè)及一種可抑制STAT3表達和防治慢性移植物抗宿 主病的shRNA小分子祀向藥物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性移植物抗宿主病 kbonic graft versus host disease, cGVHD)是異基因 造血干細胞移植（allogeneic hemapoietic stem cells transplant, allo-HSCT)長期存 活患者的主要并發(fā)癥，不僅嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，也是導(dǎo)致非復(fù)發(fā)死亡的主要原因。隨 著allo-HSCT的廣泛開展，約30%~70%患者可在移植后中位4~6個月發(fā)生不同程度的 cGVHD，嚴(yán)重限制了 allo-HSCT的應(yīng)用和發(fā)展。GV皿主要是由于有免疫活性的供體來源T細 胞與受體組織反應(yīng)的結(jié)果。目前研究認(rèn)為，cGV皿主要是由于供者自身反應(yīng)性T細胞的活化 所引發(fā)的免疫排斥，現(xiàn)有免疫抑制治療多W抑制T細胞活化為主要出發(fā)點，盡管運些措施 能夠在一定程度上減少移植排斥，但是仍存在白血病等復(fù)發(fā)，甚至由于過度免疫抑制而引 發(fā)致命性感染、繼發(fā)第二腫瘤等并發(fā)癥，而抑制不足則導(dǎo)致cGV皿難W控制。尋找更有效、 更精確調(diào)控機體免疫抑制效果的新策略是移植領(lǐng)域研究的熱點，亦可能是解決移植排斥并 發(fā)癥的根本出路。
[0003] 近年來，利用RNA干擾技術(shù)，將化學(xué)合成的短發(fā)夾干擾RNA(shod hai巧in RNA， ShRNA)轉(zhuǎn)導(dǎo)至特定的細胞，沉默相關(guān)基因的表達，是研究基因功能最有效的手段之一，也是 祀向基因治療最有吸引力的方法之一。選擇特異性的祀基因合成有效的ShRNA,并且選擇 合適轉(zhuǎn)染方式，使其在宿主細胞中高效作用，是實施運一祀向治療措施的重點。有效的祀 向治療是目前國內(nèi)外不斷在尋找的治療方法。幼稚CD4+Th細胞可W被活化并分化成熟為 有不同功能的效應(yīng)性化細胞?；?7細胞是在自身免疫性疾病發(fā)病機制的研究中，新發(fā)現(xiàn) 一個分泌IL-17,但其分化不依賴于化1或化2分化所需的細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的CD4+T 細胞亞群?；?7細胞在自身免疫性疾病和移植排斥領(lǐng)域有較廣泛的研究，但有關(guān)化17在 GV皿發(fā)生發(fā)展中的作用，近年才開始引起學(xué)者關(guān)注。我們的前期研究應(yīng)用基因表達譜忍片 發(fā)現(xiàn)STAT3及IL-17A、比-21在cGVHD病人表達升高，并且發(fā)現(xiàn)cGV皿患者外周血中存在 化17 t /Treg I失衡。新近研究發(fā)現(xiàn)：JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是化細胞極化的重要通路， 其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 (si即曰1 transducer and activator of transcription 3) STAT3是化17細胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心是T細胞向化17或化eg分化的"支點"， 調(diào)控化17和Treg之間的動態(tài)平衡。
[0004] 我們在前期研究基礎(chǔ)上結(jié)合免疫領(lǐng)域最新熱點，首次提出通過阻斷STAT3,對 Thl7/Treg平衡進行調(diào)控，從而達到抑制cGV皿的研究思路。探討阻斷STAT3信號對誘導(dǎo) 化17、Treg分化及其相互調(diào)控的作用及機制，闡明化17/Treg "漂移"在cGV皿發(fā)生發(fā)展過 程中的作用，為進一步尋求cGV皿的免疫治療新祀點提供實驗依據(jù)。祀向針對STAT3基因 的shRNA序列對于開發(fā)新的抗cGVHD基因藥物和提高cGV皿的治療效果有重要的意義，具 有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種能高效抑制STAT3表達和防治慢性移植物抗宿 主病的shRNA。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種抑制STAT3表達和防治慢性移植物抗 宿主病的shRNA，合成序列如下所示：
[0007] 正義鏈：
[0008]日' -TCGACTTTGATTTCAACTACAACTCGAGTTGTAGTTGAAATCAAAGTCGTTTTTTC-3，反義 鏈：
[0009] 5 ^ -TCGAGAAAAAACGACTTTGATTTCAACTACAACTCGAGTTGTAGTTGAAATCAAAGTCGA-3 ^
[0010] 所述的shRNA應(yīng)用于抑制STAT3基因（NM_213659)的表達。祀向序列為 ACTTTGATTTCAACTACAA。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種可高效抑制或治療慢性移植物抗宿主病的藥物。
[0012] 該藥物含有如上所述的ShRNA作為藥物的活性成分。該藥物是通過慢病毒載體感 染宿主細胞將shRNA藥物整合至目的基因組，從而抑制STAT3基因表達和防治慢性移植物 抗宿主病。
[0013] 制備上述可高效抑制或治療慢性移植物抗宿主病的藥物步驟如下：
[0014] 針對小鼠STAT3基因序列，利用公用網(wǎng)站中提供的RNA干擾（RNAU序列設(shè)計原 貝1J，針對不同的祀點設(shè)計3條RNA干擾序列及RNAi陰性對照序列，選擇最佳的動力學(xué)參 數(shù)祀點進入后續(xù)實驗流程。合成含有干擾序列的單鏈DNA oligo,然后退火配對產(chǎn)生雙 鏈。通過慢病毒感染宿主細胞達到將ShRNA藥物整合至目的基因組，其制備過程為：將合 成的雙鏈ShRNA,通過其兩端所含酶切位點直接連入酶切后的慢病毒載體上；將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)入制備好的細菌感受態(tài)細胞，PCR鑒定陽性重組子后，送測序驗證；測序結(jié)果經(jīng)比對確認(rèn) 正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNAi及陰性對照慢病毒載體質(zhì)粒。同時制備重組慢 病毒質(zhì)粒的兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，=種載體質(zhì)粒分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，按 Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用說明進行共轉(zhuǎn)染293T細胞，收集富含慢病毒顆 粒的細胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細胞中測定并標(biāo)定病毒 滴度。免疫磁珠分選小鼠脾CD4-CD62L-|m丫vcT細胞，活化7化后感染STAT3-shRNA及陰性 對照慢病毒，9化留取各組細胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，巧光定量PCR(染料法）驗證 mRNA水平的STAT3干擾效果，篩選出權(quán)利要求1所述的shRNA用于正式實驗。
[0015] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0016] 1、本發(fā)明的抑制STAT3表達的shRNA是通過慢病毒感染小鼠脾 CD4-CD62L-naTvcT細胞，經(jīng)檢測干擾效果篩選得到的；能高效抑制STAT3基因的表達，與陰 性對照組比較，mRNA水平的下調(diào)程度達到52倍左右，如圖1、2,表3所示。
[0017] 2、本發(fā)明的抑制STAT3表達的ShRNA通過慢病毒載體作用于小鼠脾 CD4XD6化-naVvcT細胞后，影響各亞群分化方向（如表4)，其中化17比例降低，Treg比 例增高（如圖3、4所示），Thl7/Treg比值降低，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0. 05)。
[0018] 3、本發(fā)明的抑制STAT3表達的shRNA通過慢病毒載體作用于小鼠骨髓CD117+早 期干祖細胞后（圖5)，巧光定量PCR檢測STAT3-shRNA慢病毒感染小鼠骨髓CD117+早期干 祖細胞9化時STAT3基因的相對表達量（內(nèi)參照基因為GAPDH)，與陰性對照組、空白對照組 比較，STAT3-shRNA干擾組STAT3基因在mRNA水平的相對表達量均數(shù)的差別均有統(tǒng)計學(xué)意 義任<0.001，P<0.001);陰性對照組與空白對照組比較，STAT3基因在mRNA水平的相對表 達量均數(shù)的差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0. 063)(圖6)。干擾組細胞增殖活力（如表5、圖7)、 早期調(diào)亡率（如表6、圖8)及體外分化為各系造血集落的能力（如表7、圖9)，與對照組比 較，均無顯著性差異（P〉〇. 05)，說明其安全性。
[0019]4、本發(fā)明的抑制STAT3表達的shRNA應(yīng)用于活體內(nèi)治療小鼠cGV皿模型，cGV皿臨 床評分（如表8、圖10)及祀器官病理評分（如表9、圖11-12)均降低，與陰性對照組比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<〇. 05)。
[0020] 5、設(shè)及STAT3基因的shRNA序列對于開發(fā)新的抗cGVHD基因藥物和提高cGV皿的 治療效果有重要的意義，具有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。
[0021] 本發(fā)明的ShRNA可用于抑制STAT3基因的表達，用于制備治療慢性移植物抗宿主 病的小分子祀向藥物，通過慢病毒載體感染并整合至目的細胞基因組，沉默STAT3基因的 表達，發(fā)揮治療作用。
【附圖說明】
[0022] 圖1是實施例1中通過巧光顯微鏡觀察STAT3-shRNA慢病毒感染小鼠 CD4*CD技2L：%泡veT細胞，其中（a)是空白對照組在200倍白光度ri曲t)情況下所進行的顯 微鏡觀察；化）是空白對照組在200倍巧光（GF巧情況下所進行的顯微鏡觀察；（C)是空白 對照組在200倍白巧光融合（Merge)情況下所進行的顯微鏡觀察；（d)是shRNA2組在200 倍白光度ri曲t)情況下所進行的顯微鏡觀察；（e)是shRNA2組在200倍巧光（GFP)情況 下所進行的顯微鏡觀察；（f)是shRNA2組在200倍白巧光融合（Merge)情況下所進行的顯 微鏡觀察。
[002引 圖2是實施例1中通過巧光定量PCR檢測STAT3-shRNAl、2、3慢病毒及陰性對照 病毒感染小鼠脾拉換化瓜粧L+n疏妃T細胞9化時STAT3基因的mRNA水平相對表達量。
[0024] 圖3是實施例2中通過流式細胞術(shù)檢測STAT3-shRNA2慢病毒及陰性對照病毒感 染小鼠脾〔04-(；'0(。丄-11獻燈細胞96^寸〔04乂025中(卿3+化6邑亞群細胞，其中（曰）表示設(shè) 口，紫色代表干擾組CD4+的細胞群，化）表示干擾組Treg亞群細胞同型對照，（C)表示干擾 組Treg亞群細胞，（d)表示設(shè)口，紫色代表陰性對照組CD4+的細胞群，（e)表示陰性對照組 Treg亞群細胞同型對照，（f)表示陰性對照組Treg亞群細胞。
[00巧]圖4是實施例2中通過流式細胞術(shù)檢測STAT3-shRNA2慢病毒及陰性對照病毒感 染小鼠脾CD4了D62L.-nalfveT細胞9化時CD4+比-17A+Thl7亞群細胞，其中（a)表示設(shè)口， 紫色代表干擾組CD4+的細胞群，化）表示干擾組化17亞群細胞同型對照，（C)表示干擾組 化17亞群細胞；（d)表示設(shè)n，紫色代表陰性對照組CD4+的細胞群，（e)表示陰性對照組 化17亞群細胞同型對照（f)表示