能抑制豬流感病毒的shRNA轉基因重組質粒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳工程技術領域，具體地說，設及一種能抑制豬流感病毒的ShRNA 轉基因重組質粒及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬流感（Swine Influenza, SI)是由正粘病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒 (Influenza A virus, IAV)引起的一種急性、高度接觸傳染的呼吸道疾病，臨床癥狀表現(xiàn) 為，發(fā)熱、咳嗽、流鼻涕，結膜炎、厭食及精神不振等。豬流感病毒（Swine Influenza Virus， SIV)能在豬上呼吸道上皮細胞內復制，造成豬感染，致使豬體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，導致 細菌、支原體和其他病毒的繼發(fā)或混合感染，使疫情加重，病豬死亡率上升，給養(yǎng)豬業(yè)帶來 極大經(jīng)濟損失。越來越多的資料表明，豬作為流感病毒的"混合器"，在流感病毒跨種屬障礙 感染新宿主的過程中，起著重要的作用。豬上皮細胞具有唾液酸a-2, 6半乳糖巧和唾液酸 a -2, 3半乳糖巧，人流感病毒可與前者結合，而禽流感病毒與后者結合，由此決定了能夠同 時被人流感病毒和禽流感病毒感染，使其成為IAV發(fā)生基因重組或重排的主要場所。豬流 感HA受體結合位點具有與兩種流感病毒受體相同的結合特異性，是SIV不僅可感染豬，同 時也具有感染禽和人類的能力。因此，豬流感除了具有獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義外，還具有深遠的 人類公共衛(wèi)生意義。
[0003] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是指RNA對基因表達的調控，由 dsRNA (double-strand RNA)或 siRNA (small inte;rfe;ring RNA，siRNA)引發(fā)的對同源性 mRNA降解的現(xiàn)象。它最大優(yōu)點在于具有高度的有效性和特異性，且具有快速的預防與治療 效果。它的作用在基因功能研究和病毒性疾病的治療領域有非常廣闊的前景，例如在抗艾 滋病毒化IV)、乙型肝炎病毒化BV)、脊髓灰質炎病毒（Poliovirus)等病毒病的研究中都發(fā) 現(xiàn)，RNAi對于抑制運些病毒的復制具有較好的效果，可能是運類病毒病治療的有效途徑。
[0004] A型流感病毒（IAV)屬于正粘病毒科，是單股負鏈RNA病毒，W變異速度快、感染致 病性強、傳播速度快成為造成人、哺乳動物和禽類流感大流行的主要病毒。目前抗病毒藥物 和疫苗免疫存在局限性，使病毒對藥物產(chǎn)生耐受性，迫于選擇壓力病毒會快速發(fā)生變異W 逃避藥物或疫苗免疫；研究人員選擇RNAi方法抑制流感病毒的復制通常針對流感病毒基 因的保守序列作為祀序列，由于干擾序列的高度轉移性，使RNAi技術在流感病毒防治的應 用中也遇到了技術屏障。因此，亟需開發(fā)一種基于RNAi技術的抗病毒治療新方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能抑制豬流感病毒的ShRNA轉基因重組質粒及其應用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種能抑制豬流感病毒復制與感染的 shRNA,所述shRNA是W豬流感病毒PB2, W及任選PA、PB1、NP中的至少兩種為祀基因，編碼 所述shRNA的核巧酸序列為（如SEQ ID No. 1-8所示的核巧酸序列）：
[0007]
[0008] 具體的，在本發(fā)明的一種實施方式中，shRNA W豬流感病毒PB2、PA、PB1和NP為祀 基因；
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，shRNA W豬流感病毒PB2、PA和PB1為祀基因；
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，shRNA W豬流感病毒PB2、PA和NP為祀基因；
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，shRNA W豬流感病毒PB2、PB1和NP為祀基因。
[0012] 本發(fā)明還提供一種能抑制豬流感病毒的shRNA轉基因重組質粒，所述質粒共含有 =個或四個shRNA表達盒，即含有W豬流感病毒PB2為祀基因的shRNA表達盒，W及任選豬 流感病毒PA、PB1、NP中的至少兩種為祀基因的shRNA表達盒。
[0013] 其中，W豬流感病毒PA為祀基因的shRNA表達盒在h7SK啟動子控制下，W豬流 感病毒PB1為祀基因的shRNA表達盒在hHl啟動子控制下，W豬流感病毒PB2為祀基因的 shRNA表達盒在WJ6啟動子控制下，W豬流感病毒NP為祀基因的shRNA表達盒在mU6啟動 子控制下，且各表達盒呈串聯(lián)狀態(tài)。
[0014] 上述RNA聚合酶III型啟動子h7SK、抽1、WJ6和mU6使各shRNA表達盒在真核細 胞中穩(wěn)定持續(xù)表達。每個啟動子具有精確的堿基啟動位點和終止信號，可W保證ShRNA最 高效地被啟動轉錄，
[0015] 前述重組質粒的出發(fā)質粒為pGenesil-EGFP。
[0016] 前述出發(fā)質粒中含有嚷嶺霉素抗性基因。
[0017] 將本發(fā)明構建的重組質粒分別記為口66116311-口4斗81斗82、口66116311-PA-PB1-NP、pGenesil - PA-PB2-NP、pGenesil - PB1-PB2-NP與pGenesil - PA-PB1-PB2-NP， 它們分別含有S個或四個ShRNA表達基因，能同時編碼S種或四種豬流感病毒基因組PA、 PB1、PB2與NP基因保守區(qū)域的特異shRNA。
[0018] 本發(fā)明還提供含有編碼前述能抑制豬流感病毒復制與感染的shRNA的DM的轉基 因細胞、宿主及工程菌。
[0019] 本發(fā)明還提供含有前述重組質粒的轉基因細胞、宿主細胞及工程菌。
[0020] 本發(fā)明所述的細胞為真核細胞，來自人、哺乳動物和/或禽類。
[0021] 本發(fā)明還提供所述重組質粒在轉基因育種中的應用。
[0022] 所述應用是將所述重組質粒轉入哺乳動物，使轉基因動物后代抵抗流感病毒感 染，提高抗病能力。
[0023] 本發(fā)明進一步提供所述重組質粒在抑制豬流感病毒復制與感染中的應用。所述重 組質粒可W應用于制備抑制豬流感病毒復制與感染的藥物組合物。
[0024] 所述應用是將所述重組質粒經(jīng)靜脈注射或肌肉注射到哺乳動物體內，使動物能抵 抗流感病毒感染，提高抗病能力。
[00巧]優(yōu)選地，所述哺乳動物為豬。
[0026] 本發(fā)明將shRNA表達盒通過酶切構建到慢病毒表達載體，獲得復制缺陷性慢 病毒，分別命名為 pLV-EGFP-shPAPBlPB2、pLV-EGFP-shNPAPBl、pLV-EGFP-shNPAPB2、 pLV-EGFP-shNPBlPB2與pLV-EGFP-shNPAPBlPB2。經(jīng)重組慢病毒滴度檢測確定慢病毒滴度。
[0027] 用所述復制缺陷型慢病毒感染MDCK細胞，2yg/血嚷嶺霉素抗性篩選，建立整 合有目的基因的細胞系，分別命名為shPAPBlPB2-MDCK、shNPAPBl-MDCK、shNPAPB2-MDCK、 shNPBlPB2-MDCK、shNPAPBlPB2-MDCK 與 Mock-MDCK。
[0028] 本發(fā)明采取了多基因干擾ShRNA基因串聯(lián)構建到一個質粒載體上的策略，并且對 =基因與四基因串聯(lián)進行比較，首次證明了四基因串聯(lián)質粒載體對H1N1豬流感病毒的抑 制作用高于=基因，多基因干擾ShRNA在H1N1豬流感病毒復制周期中發(fā)揮更強的抑制作 用。
[0029] 經(jīng)攻毒實驗首次證明，表達四基因shNPAPBlPB2-MDCK細胞系不僅能抵抗化N1亞 型豬流感病毒，還能抵抗H3N2亞型豬流感病毒，此外，還能抵抗冊N1亞型禽流感病毒，具有 對不同毒株交叉抑制的潛力。
[0030] 本發(fā)明通過靜脈注射與肌肉注射兩種方式接種ShRNA表達載體，比較兩種給藥途 徑研究shRNA對H3N2亞型豬流感病毒的抑制作用，結果首次證明靜脈注射的shRNA有更好 地抑制H3N2亞型豬流感病毒的作用。
[0031] 本發(fā)明構建的能抑制豬流感病毒的shRNA轉基因重組質粒，該質粒含有四個 shRNA表達基因，能同時編碼四種分別祀向流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因保守區(qū)域的特異 shRNA;四個shRNA表達基因分別在四個啟動子h7SK、hHl、WJ6、mU6的控制下，呈串聯(lián)狀態(tài)。 該質粒適用于多種轉基因技術。使用慢病毒載體將該質粒轉入體外培育的MDCK細胞后，經(jīng) 攻毒實驗證明，篩選得到的轉基因細胞系具有抵抗不同亞型流感病毒感染的能力。將該質 粒通過靜脈與肌肉注射入4周齡仔豬，然后用H3N2亞型豬流感病毒感染，發(fā)現(xiàn)經(jīng)血液注射 組具有更強的抑制流感病毒的復制。為RNAi應用于豬流感病毒的研究W及豬流感的防治 積累了必要的實驗數(shù)據(jù)，為轉基因豬抗流感研究奠定基礎。
【附圖說明】
[0032] 圖1為本發(fā)明實施例2中重組慢病毒載體的構建原理。
[0033] 圖2為本發(fā)明實施例2中重組慢病毒載體上串聯(lián)ShRNA基因和報告基因的排列。
[0034] 圖3為本發(fā)明實施例2中重組慢病毒感染MDCK細胞4化后巧光圖；其中，A-E : 1〇1-105重組慢病毒接種MDCK細胞，F(xiàn) :陰性對照。
[0035] 圖4為本發(fā)明實施例3中H1N