LncRNA-GAS5在制備青光眼診斷試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和分子診斷領(lǐng)域，具體設(shè)及LncRNA-GAS5在制備青光眼診斷 試劑中的應(yīng)用，W及一種青光眼LncRNA-GAS5診斷試劑盒，可根據(jù)個(gè)體的LncRNA-GAS5表達(dá) 水平進(jìn)行人類青光眼病變的診斷及病情發(fā)展的判斷。
【背景技術(shù)】
[0002] 青光眼是一種常見的眼科疾病，W眼壓升高或波動(dòng)較大、視神經(jīng)萎縮和視野缺損 為特征。青光眼目前是導(dǎo)致人類失明的=大致盲眼病之一，總?cè)巳喊l(fā)病率為1 %，45歲W后 為2%?；颊咴缙诓]有明顯的癥狀，直至開始出現(xiàn)明顯視野缺損時(shí)，方才檢查出青光眼，但 此時(shí)的視力損害已不可逆。目前，青光眼的治療方式包括藥物、激光和手術(shù)等，運(yùn)些方法雖 然可W降低眼內(nèi)壓，延緩青光眼疾病的發(fā)生，但是視神經(jīng)萎縮和視野缺損很難被逆轉(zhuǎn)。因此 亟待對(duì)青光眼的發(fā)生進(jìn)行早期診斷，尋找出新型無創(chuàng)的、高靈敏度和特異性的生物標(biāo)志物。
[0003] 長鏈非編碼RNA (LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過20化t的RNA分子，它們雖然不 編碼蛋白產(chǎn)物，但是可W在多個(gè)層面（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控W及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基 因的表達(dá)。它們可W調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞分化、增殖和調(diào)亡，而且其LncRNA表達(dá) 異常與眾多人類疾病發(fā)生密切相關(guān)，包括癌癥、屯、血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病。
[0004]生長阻滯特異轉(zhuǎn)錄物 5 (Growth arrest-specific tran-script 5, Gas5, NCBI Reference Sequence:NR_002578. 2)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞調(diào)亡和生長的關(guān)鍵調(diào)控因子。Ga巧通 過模擬糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件來結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體（Glucoccxrticoid receptor)的DNA結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，阻止糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件的相互作用，從而抑制下游基因的 表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生。目前，尚無LncRNA-CAS5作為青光眼診斷的生物學(xué)標(biāo)記物的 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供了 LncRNA-GAS5的新的用途，可作為診斷試劑用于青光眼病 變的早期診斷。
[0006] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下： 核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示的LncRNA-GAS5在制備診斷制備青光眼病變?cè)\斷試劑 中的應(yīng)用，特別是青光眼的早期診斷。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種青光眼病變?cè)\斷的LncRNA-GAS5檢測(cè)試劑盒， 試劑盒包括RNA抽提體系、RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)體系，其中PCR反應(yīng)體系含有特 異性擴(kuò)增SEQ ID NO: 1基因序列的引物序列。
[0008] 上述檢測(cè)試劑盒中RNA抽提體系包括總RNA提取試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括 反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；PCR反應(yīng)體系包括擴(kuò)增系統(tǒng)和引物系統(tǒng)，所 述擴(kuò)增系統(tǒng)由SYBR Premix Ex化q?試劑組成；所述引物系統(tǒng)包括RNA反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物和 GAS5特異性的qRT-PCR的引物，其中， RNA反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物為GAPDH和/或Beta-tubulin的定量PCR引物序列， GAPDH定量PCR引物序列，上游引物序列如SEQ ID N0:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示； GAS5特異性的qRT-PCR的上游引物如SEQ ID NO:4所示，下游引物如SEQ ID NO: 5所 示；Beta-化bulin定量PCR引物序列，上游引物序列如SEQ ID N0:6所示，下游引物序列如 沈Q ID NO:7所示。
[0009] 上述的檢測(cè)試劑盒，包括： (a)抽提體系 1) Trizol reagent, 1 管，2000 y L/ 管； 2) 氯仿，1管，500 yL/管； 3) 無水乙醇，1管，8000化/管； 4) DEPC d地2〇, 1 管，1000 y L/ 管； 5) (1地2〇，1 管，2000 yL/管； 6) 異丙醇，8000 iiL/管； 化）反轉(zhuǎn)錄體系 1) 總 RNA 反轉(zhuǎn)錄引物（包括 Oligo dT 和 Random6mers)，1 管，濃度：50 y M，50 y L/ 管； 2) 反轉(zhuǎn)錄酶（200U/ y L) 50 y L ; 3) dNTP Mixture(lOmM each)50yL ； 4) 反轉(zhuǎn)錄 buffer 50 yL; (c) PCR體系 1) SYBR Premix Ex Taq 酶； 2) buffer 100yL ； 3) GAS5特異性qRT-PCR的上游引物，1管，10 yM，100 y L/管； GAS5特異性qRT-PCR的下游引物，1管，10 yM，100 y L/管； GAPDH定量PCR上游引物，1管，10 yM，100 yL/管； GAPDH定量PCR下游引物，1管，10 yM，100化/管； 和 / 或，Beta-Uibulin 定量 PCR 上游引物，1 管，10 y M，100 y L/ 管； Beta-tubulin 定量 PCR 下游引物，1 管，10 yM，100 yL/管； 4) dNTP Mixture (lOmM each)50jiL〇
[0010] 本發(fā)明確定了 LncRNA-GAS5表達(dá)量的改變，與青光眼的發(fā)生存在顯著地相關(guān)性。 LncRNA-GAS5可W作為青光眼早期診療的生物標(biāo)記物，定期評(píng)估青光眼的進(jìn)展和手術(shù)后的 復(fù)發(fā)情況。
[0011] 本發(fā)明中確定LncRNA-GAS5作為青光眼診斷的生物標(biāo)記物包括如下步驟： 第一步：樣本準(zhǔn)備：眼科青光眼手術(shù)后小梁網(wǎng)樣本（實(shí)驗(yàn)組，n = 20)和外傷病人的小 梁網(wǎng)樣本（對(duì)照組，n = 20)，RNA采用TRIzolQnvitrogen)試劑提取，并保存于-80°C備 用。
[0012] 第二步：差異表達(dá)IncRNA篩選：采用美國Aglient公司的IncRNA表達(dá)譜忍 片，分析青光眼疾病發(fā)生相關(guān)的IncRNA。分析具體步驟為：采用標(biāo)記酶將巧光基團(tuán)標(biāo)記 IncRNA,得到用于與忍片雜交的巧光探針，在標(biāo)注條件下使用MAUI雜交儀和忍片雜交；使 用GenePix 4000B忍片掃描儀掃描忍片的巧光強(qiáng)度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)值型數(shù)據(jù)進(jìn)行 保存；采用Genespring GX軟件分析找出青光眼發(fā)生相關(guān)的IncRNA分子；運(yùn)時(shí)會(huì)篩選出一 系列的差異表達(dá)IncRNA，然后結(jié)合GO和KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)合TRANSFAC和catRAPID數(shù) 據(jù)庫，最終確定LncRNA-GAS5作為祀點(diǎn)用于后續(xù)的測(cè)定。
[0013] 第S步：采用定量PCR驗(yàn)證忍片分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0014] 第四步：驗(yàn)證祀點(diǎn)LncRNA-GAS5在青光眼病人、正常人和手術(shù)治療青光眼病人血 漿和血細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異。
[0014] 本發(fā)明的另一目的在于提供LncRNA-GAS5反義核巧酸在制備治療青光眼藥物中 的應(yīng)用，反義核巧酸序列如SEQ ID NO:8所示。。
[0015] LncRNA-GAS5反義核巧酸與祀LncRNA-GAS5互補(bǔ)，抑制或封閉基因的轉(zhuǎn)換和表達(dá)， 或誘導(dǎo)化ase H識(shí)別或切割LncRNA-GAS5,使其喪失功能，因此可W作為藥物用于治療青光 眼。
[0016] 本發(fā)明為青光眼疾病的早期診斷、預(yù)后判斷和早期干預(yù)治療提供重要的參考依 據(jù)，具有較大的實(shí)際臨床價(jià)值，可W用于篩選出青光眼疾病的高危人群和復(fù)發(fā)人群，W期及 早進(jìn)行干預(yù)和治療，減少非高危復(fù)發(fā)病人不必要的治療和醫(yī)療花費(fèi)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為IncRNA忍片分析篩選青光眼發(fā)生相關(guān)的IncRNA (圖A為箱線圖分析忍片的 質(zhì)量，其中每7個(gè)樣本混合構(gòu)成一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，消除個(gè)體差異；圖B為散點(diǎn)圖從整體上顯 示青光眼和非青光眼樣本的IncRNA表達(dá)差異；圖C為聚類圖從整體角度，分析青光眼和非 青光眼樣本的IncRNA表達(dá)差異；圖D為火山圖篩選青光眼相關(guān)的IncRNA ;圖E為定量PCR 驗(yàn)證忍片分析結(jié)果。
[0018] 圖2為定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人房水的表達(dá)差異。
[0019] 圖3為定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人玻璃體的表達(dá)差異。
[0020] 圖4為定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人血漿和血細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化。
【具體實(shí)施方式】
[0021] W下通過實(shí)施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實(shí)施例限制。
[0022] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理 解的含義。
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例只 是為了舉例說明本發(fā)明，而非W任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 在W下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[00巧]實(shí)施例lLncRNA-GAS5與青光眼病變相關(guān)性驗(yàn)證 (1) IncRNA忍片分析篩選青光眼疾病有關(guān)的IncRNA并進(jìn)行驗(yàn)證 第一步：樣本準(zhǔn)備：青光眼手術(shù)過程收集病變的組織小梁網(wǎng)（實(shí)驗(yàn)組，n = 21)和正 常外傷人的小梁網(wǎng)（對(duì)照組，n = 21)，總RNA采用TRIzol (Invitrogen)試劑提取，并保存 于-80°C備用。
[0026] 第二步：差異表達(dá)IncRNA篩選： 采用美國Aglient公司的IncRNA表達(dá)譜忍片，分析青光眼疾病發(fā)生相關(guān)的IncRNA ;分 析具體步驟為：采用標(biāo)記酶將巧光基團(tuán)標(biāo)記IncRNA，得到用于與忍片雜交的巧光探針，在 標(biāo)注條件下使用MAUI雜交儀和忍片雜交；使用GenePix 4000B忍片掃描儀掃描忍片的巧光 強(qiáng)度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)值型數(shù)據(jù)進(jìn)行保存；各個(gè)樣本的分布如圖1A所示；各個(gè)樣本 的IncRNA整體表達(dá)分布如圖1B和圖1C所示，表明青光眼和非青光眼病理樣本之間存在顯 著地IncRNA表達(dá)差異；采用Genespring GX軟件分析找出青光眼發(fā)生相關(guān)的IncRNA分子， 運(yùn)時(shí)會(huì)篩選出一系列的差異表達(dá)IncRNA(如圖1D所示）； 第S步：采用定量PCR驗(yàn)證忍片分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如圖1E所示）；然后結(jié)合GO和KEGG 信號(hào)通路分析，根據(jù)t-test unequal impaired算法，將P < 0. 05且差異倍數(shù)在2倍W上 的IncRNA確定為差異表達(dá)LncRNA，結(jié)果表明LncRNA-GAS5在青光眼病人和正常小梁網(wǎng)內(nèi)表 達(dá)差異最大，故而推測(cè)GAS5與青光眼疾病具有較大的相關(guān)性。
[0027]第四步： 收集青光眼病人和其他非青光眼病人的房水和玻璃體的臨床樣本；采用化izol試劑 提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR的方法得到總RNA的cDNA ;通過定量PCR的方法，檢測(cè)祀點(diǎn) LncRNA-GAS5的表達(dá)水平（如圖2-4所示），圖2為定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病 人和健康人房水的表達(dá)差異，