一種NAC轉(zhuǎn)錄因子HbNAM及其編碼基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種NAC轉(zhuǎn)錄因子化NAM及其編碼基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物特異的 NAC(NAM，ATAF1/2 和 CUC)轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, T巧是目前發(fā)現(xiàn)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，通過對(duì)全基因組數(shù)據(jù)分析在模式植物擬南芥 (Ar油idopsis thaliana(L.)中發(fā)現(xiàn)有 135個(gè)NAC基因，水稻（Oryza sativa L.)中發(fā)現(xiàn) 149 個(gè)，番茄（Solanumlycopersicum L.)中發(fā)現(xiàn) 104 個(gè)，玉米狂ea mays L.)中發(fā)現(xiàn) 152 個(gè)。NAC 轉(zhuǎn)錄因子名稱來源于 no apical me;ristem(NAM)，ATAFl/2 和 cup-shaped cotyledon(CUC) 運(yùn)S個(gè)具有相似DM結(jié)合域值NA-binding doman)的蛋白。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的主要特征 是在N-末端具有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合域（NAC domain)和作為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)或抑制區(qū)發(fā) 揮功能的復(fù)雜多變C-末端。NAC domain由約160個(gè)氨基酸殘基組成，根據(jù)基序分布，又可 W將其劃分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（A-E)，A亞結(jié)構(gòu)域可能參與了同源和異源S聚體的形成，而B 和E亞結(jié)構(gòu)域可能與NAC蛋白的功能多樣性有關(guān)，其中C和D亞結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合相關(guān)。
[0003] NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物的細(xì)胞調(diào)亡，胚的發(fā)育，種子萌發(fā)，衰老，木材的形成 等生長(zhǎng)發(fā)育過程過程。越來越多的證據(jù)表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子還參與植物包括干旱，鹽脅迫， 低溫和病原菌的多種生物和非生物脅迫應(yīng)答過程。南獲（Miscanthuslutarioriparius L.) NAC基因MINA巧在擬南芥中過量表達(dá)后通過調(diào)控脅迫相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)顯著提高了擬 南芥的抗旱和耐寒性。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激反應(yīng)NAC轉(zhuǎn)錄因子（stress-responsive NAC)S1NAC4 可W誘導(dǎo)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控番茄對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性。隨著研究的深入和 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的提高，越來越多的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因被用于提高作物耐受逆境脅迫能力和品 質(zhì)改良。
[0004] 膠乳是己西橡膠樹的主要次生代謝物質(zhì)，也是天然橡膠的主要來源。目前，已從 己西橡膠樹中克隆到了部分NAC轉(zhuǎn)錄因子，但其具體功能有待于進(jìn)一步研究。本研究基于 轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，對(duì)化NAM的完整讀碼框（OR巧進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析，同時(shí) 利用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行驗(yàn)證，并通過實(shí)時(shí)巧光定量PCR技 術(shù)巧eal time-PCR)分析了該基因的組織表達(dá)特性W及割膠、外源激素萊莉酸（jasmonic acid, JA)和乙締利（eth巧hon, ET)處理W及低溫脅迫對(duì)基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明己 西橡膠樹化NAM轉(zhuǎn)錄因子基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答中的功能提供了研究基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的在于提供一種從己西橡膠樹中克隆的新的NAC轉(zhuǎn)錄因子化NAM，本 發(fā)明還提供了該NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，W實(shí)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫 應(yīng)答中的功能的進(jìn)一步研究。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種NAC轉(zhuǎn)錄因子化NAM的編碼基因，其核巧酸序列 如沈Q ID NO :1所示。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種NAC轉(zhuǎn)錄因子化NAM,由SEQIDNO:1所示核巧 酸序列編碼而成。
[0008] 本發(fā)明的第=個(gè)方面是提供含有本發(fā)明第一個(gè)方面所述的編碼基因的表達(dá)載體。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供含有本發(fā)明第一個(gè)方面所述的編碼基因的細(xì)胞系。
[0010] 本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供含有本發(fā)明第一個(gè)方面所述的編碼基因的宿主菌。
[0011] 本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的編碼基因在提高宿主菌耐 寒性中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第屯個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的編碼基因在提高植物抗寒 性中的應(yīng)用。 陽01引本發(fā)明從己西橡膠樹中分離得到NAC轉(zhuǎn)錄因子化NAM，對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子在己西橡膠 樹中功能的進(jìn)一步研究具有重要意義。試驗(yàn)證實(shí)化NAM在葉中的表達(dá)量高于其他部位，受 割膠、萊莉酸（JA)和乙締巧T)處理W及低溫脅迫調(diào)控，可提高轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)低溫脅迫的耐 受力，并反向調(diào)控轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞對(duì)干旱脅迫的耐受力，可用于植物的抗逆基因工程的研 究，具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為化NAM基因的核巧酸序列和氨基酸序列，其中，下劃線部分為NAC domain; *為終止密碼子；
[0015] 圖2為化NAM的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中，左邊數(shù)字表示bootstrap value,括號(hào)中為氨基 酸序列登錄號(hào)，框中標(biāo)示為化NAM;
[0016] 圖3為化NAM與其它植物NAC蛋白的氨基酸序列比對(duì)，其中下劃線表示NAC domain中的5個(gè)保守亞結(jié)構(gòu)域A~E ;*表示NAM亞家族的保守基序；
[0017] 圖4為化NAC轉(zhuǎn)錄因子保守域的分析，其中，（A化bNAC轉(zhuǎn)錄因子保守域示意圖，做 化NAC轉(zhuǎn)錄因子保守域氨基酸序列信息； 陽0化]圖5為化NAM的轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)，其中A.載體構(gòu)建示意圖；B.化NAM的轉(zhuǎn)錄激活功 能分析；
[0019] 圖6為化NAM的表達(dá)分析；
[0020] 圖7為轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞的抗逆性的影響結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，W更好地理解本發(fā) 明。
[0022] 1材料與方法
[0023]1. 1材料
[0024] 本研究所用己西橡膠樹均來自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。材料處理：（1)采 集正常割膠的熱研7-33-97橡膠樹的不同組織，如葉片、雄花和雌花、樹皮和膠乳，液氮凍 存?zhèn)溆?。?)割膠處理，選用未開割熱研7-33-97橡膠樹，按照1/2樹圍，3天1刀的正常大 田割制，用液氮采集第1刀、第4刀和第7刀膠乳凍存?zhèn)溆?。?)外源激素JA和ET處理，處 理方法參照康桂娟等^ 26 27^。（4)低溫脅迫處理：取低溫敏感無性系熱星501和耐寒無性系 93-114芽接苗于4°C培養(yǎng)箱低溫培養(yǎng)，處理2、4、6和化時(shí)分別用液氮采集葉片用于提取總 RNA。每種實(shí)驗(yàn)處理均設(shè)置=個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括6棵樹。 陽0巧]1. 2方法
[0026] 1. 2. 1總RNA的提取和cDNA合成
[0027] 己西橡膠樹不同組織總RNA的提取方法參照An等?。利用化rmentas公司的 Reve;rtAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA。
[0028] 1. 2. 2化NAM基因的克隆與生物信息學(xué)分析
[0029] 依據(jù)本課題組前期從己西橡膠樹轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的一段具有NAC domain的EST序 列，對(duì)該EST序列進(jìn)行克隆測(cè)序驗(yàn)證并利用此段序列捜索基因組。利用SoftBerry-FGE肥甜 網(wǎng)站對(duì)捜索結(jié)果進(jìn)行基因預(yù)測(cè)分析得到該NAC轉(zhuǎn)錄因子的0RF序列，并將該NAC轉(zhuǎn)錄因子 命名為化NAM。根據(jù)基因預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物化NAMF和化NAMR(表1)，W己西橡 膠樹膠乳cDNA為模板對(duì)化NAM基因的0RF全長(zhǎng)進(jìn)行克隆驗(yàn)證。PCR反應(yīng)條件為95 °C變性 30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收后連接PMD-18T Vector轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞D冊(cè)a，挑取陽性克隆測(cè)序。
[0030] 表1本文所用引物序列
[0031] Table 1 Primersequences used in this paper
[0032]
[0033] 利用GSDS化ttp://gsds. cbi. pku. edu. cn/index.地p)進(jìn)行基因內(nèi)含子和外顯子 分析，將外顯子序列拼接得到的ORF輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF finder進(jìn)行驗(yàn)證和blast 比對(duì)。利用 Inte;rP;roScan5 軟件（ht1:p://www. ebi.ac.址/Tools/pfa/lprscan5/)和 MEME(ht1:p://meme-suite. org/tools/meme)預(yù)測(cè)保守功能域，并利用 DNAMAN(v 5. 10)和 MEGA5. 05化ttp://www. megasoftware, net/index.地P)進(jìn)行多重比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹。
[0034] 1. 2. 3化NAM轉(zhuǎn)錄激活功能分析
[0035]根據(jù)保守功能域預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)引物（表1)將