以淀粉為原料制備葡萄糖-1-磷酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種憐酸葡萄糖的制備方法，具體設(shè)及一種W淀粉為原料制備葡萄 糖-1憐酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖-1-憐酸（G-1-巧廣泛存在于動植物W及微生物中，在生物體中起著重要 的作用。G-1-P是糖原等多糖降解的第一個產(chǎn)物，可W在葡萄糖憐酸變位酶巧C 5. 4. 2. 2) 的作用下生成葡萄糖-6-憐酸，進(jìn)入EMP途徑；也可W在核酸二憐酸葡萄糖焦憐酸化酶的 催化下合成核酸二憐酸葡萄糖（NDP-glucose)，進(jìn)一步用于各種糖巧的合成等。G-1-P在醫(yī) 藥、食品方面應(yīng)用廣泛，它能明顯阻止脂肪肝浸潤，促進(jìn)骨骼及牙齒中巧的累積，W及增強(qiáng) 巧在哺乳動物小腸內(nèi)的主動運(yùn)輸。此外，G-1-P還可W用作抗菌劑，其銷馨合物更可用于癌 癥的治療；殼聚糖/G-1-P即型水凝膠可W作為創(chuàng)面止血材料及藥物緩釋材料。
[0003] 用于生產(chǎn)G-1-P的葡聚糖憐酸化酶可^從±豆中提取，W可溶性淀粉為原料 (化tional Academy Science Letters 2013, 36 (2): 133-137)。微生物是葡聚糖憐酸化酶 的最主要來源，微生物產(chǎn)酶具有產(chǎn)量高、易分離等優(yōu)點(diǎn)。1979年，Werner等人對化ysarum polyce地alum中的a -葡聚糖憐酸化酶進(jìn)行分離純化并對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。該酶為糖原 憐酸化酶，最適溫度為30°C，最適抑為6. 7。在憐酸解方向，G-1-P與鳥巧二憐酸葡萄糖對 反應(yīng)有抑制作用，而5' -AMP則有微弱的促進(jìn)作用，可W中和G-1-P的抑制作用巧uropean Journal of Biochemistry. 1979,102:345-355)。1998 年，hkata 等人對嗜熱脂肪芽抱桿 菌中的葡聚糖憐酸化酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其最適溫度為50°C (Journal of F'ermentation and Bioengineering 1998,85(2) : 156-161)。由于耐高溫酶具有反應(yīng)速率高、不易染菌、酶穩(wěn)定 性好等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)應(yīng)用中占有極大優(yōu)勢。2005年，化ngdon等人將化ermus caldophilus 中編碼葡聚糖憐酸化酶的基因進(jìn)行克隆，在E.coli中表達(dá)，將重組葡聚糖憐酸化酶分離 純化，并對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。此重組酶的最適抑為7. 0,最適溫度為70°C，在低于70°C 時酶較穩(wěn)定，而當(dāng)溫度高于80°C時，酶活迅速下降。W可溶性淀粉為原料，在70°C下生產(chǎn) G-1-P，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)68. 78 %，是目前報道的W葡聚糖憐酸化酶催化制備G-1-P的最高值 (Process Biochemistry 2005,40:3707 - 3713)〇
[0004] 目前所有的葡聚糖憐酸化酶研究中均采用可溶性淀粉為底物，而可溶性淀粉生產(chǎn) 工藝較復(fù)雜，價格是普通淀粉的3-4倍，不適合G-1-P的大規(guī)模生產(chǎn)。如果能W廉價的普通 淀粉代替可溶性淀粉直接用作酶催化產(chǎn)G-1-P的原料，則有望顯著降低原料成本。目前， 國內(nèi)外未見有關(guān)普通淀粉制備G-1-P的報道，主要原因可能是普通淀粉在常溫下不能完全 糊化，很難直接利用。而目前已報道的用于合成G-1-P的葡聚糖憐酸化酶中，最高溫度為 70°C。一般而言，常見淀粉的糊化溫度為60-70°C，完全糊化溫度為65-75°C，若反應(yīng)溫度為 70°C，不能保證淀粉完全糊化。且70°C時各淀粉的粘度較高，如5%玉米淀粉及馬鈴馨淀粉 粘度分別為420CP及880CP。在70°C下反應(yīng)，則造成底物與酶接觸不充分，不利于反應(yīng)進(jìn)行。 所W若要有效地利用淀粉，需要尋找一種反應(yīng)溫度更高的酶，使淀粉完全糊化，體系粘度降 低。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明的目的是針對G-1-P現(xiàn)有的生產(chǎn)原料價格昂貴的問題，提供一種利用廉價 易得的普通淀粉生產(chǎn)G-1-P的方法，本發(fā)明具有原料成本低、轉(zhuǎn)化率高、G-1-P產(chǎn)量高等優(yōu) 點(diǎn)。
[0006] 一種W淀粉為原料制備葡萄糖-1-憐酸的方法，包括如下步驟：
[0007] (1)將編碼葡聚糖憐酸化酶的基因經(jīng)稀有密碼子優(yōu)化后連接到質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì) 粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中構(gòu)建重組菌；誘導(dǎo)表達(dá)所得重組菌；
[0008] (2)將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌離屯、、收集菌體，制備重組葡聚糖憐酸化酶純酶液；
[0009] (3)將所得重組葡聚糖憐酸化酶純酶液加入淀粉與緩沖液的混合溶液中，85-90°C 下反應(yīng)，得葡萄糖-1-憐酸；所述淀粉為木馨淀粉、玉米淀粉、馬鈴馨淀粉或小麥淀粉。
[0010] 步驟（1)中所述質(zhì)粒為祀T-28a(+);所述宿主菌為E.coli BL2UDE3);因此步驟 (1)進(jìn)一步優(yōu)選為：
[0011] 將編碼葡聚糖憐酸化酶的基因經(jīng)稀有密碼子優(yōu)化后連接到祀T-28a(+)質(zhì)粒上， 構(gòu)建重組質(zhì)粒祀T-28a-GP，再轉(zhuǎn)化到E. coli BL21 〇)E3)中，構(gòu)建重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)所得重 組菌。
[0012] 優(yōu)選地，所述編碼葡聚糖憐酸化酶的基因來源于最適溫度為75°C及W上極端嗜 熱菌；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述極端嗜熱菌為硫化葉菌（Sul化lobus tokodaii)或嗜熱古生菌 (Pyrococcus furiosus);最優(yōu)選為嗜熱古生菌（Pyrococcus furiosus)。
[0013] 本發(fā)明Pyrococ州s化；riosus中編碼葡聚糖憐酸化酶的基因在E. coli中重組表 達(dá)，得到的重組酶最適溫度為85-90°C，高于此前報道的其他葡聚糖憐酸化酶。本發(fā)明分別 考察了 5%的玉米淀粉和馬鈴馨淀粉在85°C保溫下化后的糊化效果，結(jié)果表明，在85°C下 淀粉可W完全糊化，兩者處理后的粘度分別為150CP及390CP，有利于底物與酶的充分接 觸，提高反應(yīng)速率。
[0014] 由于Pyrococ州S化；riosus是古生菌，培養(yǎng)困難、生長速率和產(chǎn)酶量均很低，故 擬將其基因在常見的表達(dá)體系E.coli中重組表達(dá)。但由于作為古生菌的Pyrococ州S 化riosus與E. coli的密碼子偏愛性差異顯著，若直接將其基因在E. coli中表達(dá)，會導(dǎo)致蛋 白表達(dá)量較低。為此，本發(fā)明中對Pyrococcus化riosus中編碼葡聚糖憐酸化酶的基因進(jìn) 行稀有密碼子優(yōu)化，在E. coli中重組表達(dá)，W提高酶的表達(dá)量及活力。
[0015] 編碼葡聚糖憐酸化酶的基因經(jīng)稀有密碼子優(yōu)化后的堿基序列如SEQ ID NO. 2所 示。優(yōu)化前的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0016] 步驟（1)中的誘導(dǎo)表達(dá)在常規(guī)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基上進(jìn)行，優(yōu)選地，步驟（1)中誘導(dǎo)表 達(dá)重組菌時的誘導(dǎo)條件為：在37°C下培養(yǎng)2-4.化，然后加入誘導(dǎo)劑，25-37°C繼續(xù)培養(yǎng)6-10 小時。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖巧（IPTG);誘導(dǎo)劑的濃度為 0. 05-0. 4mM〇
[0018] 最優(yōu)選的誘導(dǎo)條件為：于37°C下培養(yǎng)4h后加入0.2mM IPTG，繼續(xù)于28°C下誘導(dǎo) 培養(yǎng)化。此時重組葡聚糖憐酸化酶表達(dá)量最高。
[0019] 步驟（2)中制備重組葡聚糖憐酸化酶純酶液的方法為：將收集到的菌體破胞得粗 酶液，將所得粗酶液在85-90°C保溫20-40min使宿主菌中蛋白失活沉淀，然后離屯、、其沉 淀，所得上清液即為重組葡聚糖憐酸化酶純酶液。
[0020] 進(jìn)一步地，將收集到的菌體破胞得粗酶液，將所得粗酶液在85°C保溫30min使宿 主菌中蛋白失活沉淀，然后離屯、、其沉淀，所得上清液即為重組葡聚糖憐酸化酶純酶液，利 用此純化方法所得純酶酶活達(dá)27140U，酶活回收率達(dá)85. 31 %。
[0021] 步驟（3)中在加入重組葡聚糖憐酸化酶純酶液前對淀粉與緩沖液的混合溶液進(jìn) 行預(yù)處理，即：將淀粉與緩沖液的混合溶液在95-105°C下保溫1. 5-2. 5h。進(jìn)一步優(yōu)選地，將 淀粉與緩沖液的混合溶液在l〇〇°C下保溫化后加入重組葡聚糖憐酸化酶純酶液開始反應(yīng)， 可明顯提高整個反