一種還原型輔酶復合試劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化檢測領域，具體的，涉及一種穩(wěn)定的還原型輔酶復合試劑及其應 用。
【背景技術】
[0002] 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶I)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP， 輔酶II)，這兩種輔酶都有氧化型和還原型兩種形式，氧化型用NAD+及NADP+表示，還原型用 NADH及NADPH表示，其分子中的吡啶環(huán)可接受[H+]，在脫氫酶的作用下，它們可以傳遞作用 物分子的氫。生物體內有許多以NAD+或NADP+作為輔酶的脫氫酶，NADH和NADPH在340nm 處有特異吸收峰，所以臨床檢驗學上廣泛利用NADH和NADPH的特點，作為監(jiān)測生化反應的 指標，用來計算被測物的濃度或者活力，例如，酶法肌酐試劑、門冬氨酸轉移酶試劑、丙氨酸 氨基轉移酶試劑、a-羥丁酸脫氫酶試劑、乳酸脫氫酶試劑、尿素測定試劑等；此外，NADH和 NADPH可以作為酶循環(huán)反應的輔酶參與反應，使反應信號循環(huán)放大，提高檢測的靈敏度，例 如在總膽汁酸測定技術中，Thio-NAD可以與3a-HSD-起特異性氧化膽汁酸，生成3-酮類 固醇和還原性輔酶（NADH)，體系中有一定量的NADH存在時，又反向生成Thio-NAD和膽汁 酸，每一次循環(huán)比原來的反應提高一倍的靈敏度，如此往復循環(huán)，從而放大微量的膽汁酸， 產生大量的水溶性非染料的硫代還原型輔酶（Thio-NADH)，最后測定生成的Thio-NADH的 吸光度變化，測得總膽汁酸的含量。
[0003] 中國專利申請CN1179792A提供了一種保持還原型輔酶的方法，該方法是在反應 體系中引入一個不干擾測定的化學反應，利用酶和底物將已氧化的輔酶還原成還原型輔 酶，使得在存儲過程中還原型輔酶再生，但這種催化反應速度比較慢，實施的成本比較高、 某些酶不太容易獲得，且加入的酶本身也存在穩(wěn)定性的問題。美國專利US5278044提供了 一種脂質體包裹來穩(wěn)定還原型輔酶的方法，該方法主要用于藥物或化妝品的制作，并不適 用于臨床診斷試劑。美國專利US5278044提供了用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖體系來穩(wěn)定NADH 的方法，該方法主要特點是pH值為9. 5~11. 0,其中最佳pH值為10. 0~10. 4之間，但在 實際應用過程中過高的pH值限制了緩沖體系的選擇，且很多酶在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖體 中活力會受到影響，這就限制了其應用。中國專利申請CN1311335A提供的pH值為8. 5~ 11. 0,溶液中含有0. 5~50mM的金屬離子螯合劑的試劑；中國專利申請CN101140279A提供 了一種含有緩沖液、穩(wěn)定劑、有機溶劑、螯合劑和無機鹽的還原型輔酶的復合穩(wěn)定劑，以上 兩種試劑中均含有螯合劑，再加入某些酶時，可能會影響酶的穩(wěn)定性而限制其應用。
[0004] 現有的還原型輔酶溶液一般由還原型輔酶、金屬離子螯合劑和緩沖液、無機鹽及 有機溶劑等組成，再加入某些酶時，存在穩(wěn)定時間較短的缺陷，在2-8°C條件下儲存的過程 中，穩(wěn)定性發(fā)生變化，這種特性導致其隨著放置時間的延長試劑顏色由無色或淡黃色而逐 漸變成紅色，測定結果降低，在應用時影響檢測結果的準確性；2-8°C開蓋使用狀態(tài)下，穩(wěn)定 性發(fā)生變化，測定結果降低，不能滿足檢測的要求。
[0005] 因此有必要提供一種新的、穩(wěn)定性好、可以與某些酶類混合使用的還原型輔酶溶 液，用于臨床生化試劑中。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現有的還原型輔酶溶液在加入某些酶時，存在的穩(wěn)定時間 短的缺陷，提供了一種可穩(wěn)定還原型輔酶的復合試劑，所述復合試劑的組成成分包括：
[0007] 還原型輔酶、緩沖液和穩(wěn)定劑；其中，所述緩沖液選自由2_(環(huán)己胺）乙磺酸緩沖 液、3-(環(huán)己胺）-1_丙磺酸緩沖液、3-(環(huán)己胺）-2_羥基-1-丙磺酸緩沖液、N-三（羥甲 基）-3_氨基丙烷磺酸緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液和三乙醇胺緩沖液所 組成的組中的一種。
[0008] 可選的，所述穩(wěn)定劑選自由核苷酸、核苷酸衍生物、NaCl、KC1、MgCl2、牛血清白蛋 白和金屬離子螯合劑所組成的組中的一種或多種。
[0009] 可選的，在所述復合試劑中還原型輔酶的濃度為0. 01-10g/L，優(yōu)選為0. 5_6g/L; 緩沖液的終濃度為5-500mmol/L，優(yōu)選為10-100mm〇l/L;穩(wěn)定劑的濃度為0. 5-20g/L，優(yōu)選 為 3-10g/L。
[0010] 可選的，所述緩沖液的緩沖容量為0? 05-lmol/L。
[0011] 可選的，所述復合試劑的pH為8. 5-10. 0。
[0012] 可選的，所述緩沖液為2_(環(huán)己胺）乙磺酸緩沖液、3_(環(huán)己胺）-1_丙磺酸緩沖 液、3-(環(huán)己胺）-2-羥基-1-丙磺酸緩沖液、N-三（羥甲基）-3-氨基丙烷磺酸緩沖液、3-三 羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液或三乙醇胺緩沖液，所述穩(wěn)定劑為核苷酸、核苷酸衍生 物、NaCl、KCl、MgCl2、牛血清白蛋白、金屬離子螯合劑所組成的組中的至少一種。
[0013] 可選的，所述復合試劑還包括脫氫酶、牛血清白蛋白、有機溶劑、抗氧化劑、聚氧乙 烯類表面活性劑和防腐劑中的一種或多種。
[0014] 可選的，所述脫氫酶類為乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶和3a-類固 醇脫氫酶中的至少一種；所述有機溶劑為乙二醇、丙三醇和1. 3-丙二醇中的至少一種；所 述抗氧化劑為巰基乙醇、二硫蘇糖醇和谷胱甘肽中的至少一種；所述聚氧乙烯類表面活 性劑為聚氧乙烯十二烷基醚和聚乙二醇對異辛基苯基醚中的至少一種；防腐劑為NaNjP Proclin300中的至少一種。
[0015] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的還原型輔酶復合試劑的應用。
[0016] 可選的，所述應用包括制備總膽汁酸測定試劑、酶法肌酐試劑、門冬氨酸轉移酶試 劑、丙氨酸氨基轉移酶試劑、a-羥丁酸脫氫酶試劑、乳酸脫氫酶試劑、尿素測定試劑。
[0017] 通過上述技術方案，本發(fā)明所提供的還原型輔酶試劑，在2_8°C開蓋使用狀態(tài)下的 穩(wěn)定時間可以達到15-30天。在2_8°C密閉避光存儲過程中的穩(wěn)定時間可以達到10-15個 月。
【具體實施方式】
[0018] 下面將通過【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給 出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領域的技術人員在 不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0019] 本發(fā)明提供了一種還原型輔酶復合試劑，所述復合試劑的組成成分包括：
[0020] 還原型輔酶、緩沖液和穩(wěn)定劑；其中，所述緩沖液選自由2_(環(huán)己胺）乙磺酸緩沖 液、3-(環(huán)己胺）-1_丙磺酸緩沖液、3-(環(huán)己胺）-2_羥基-1-丙磺酸緩沖液、N-三（羥甲 基）-3_氨基丙烷磺酸緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液和三乙醇胺緩沖液所 組成的組中的一種。
[0021] 其中，還原型輔酶和穩(wěn)定劑均溶解于緩沖液中形成穩(wěn)定且均一的溶液。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述緩沖液的緩沖容量為0. 05-lmol/L。優(yōu)選的，為 了獲得更好的穩(wěn)定效果，緩沖液為N-三（羥甲基）-3-氨基丙烷磺酸（TAPS)緩沖液或3-三 羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸（TAPSO)緩沖液。
[0023] 可選的，所述復合試劑的pH為8. 5-10. 0,優(yōu)選的pH為9. 0-9. 5。
[0024] 根據本發(fā)明的復合試劑，所述穩(wěn)定劑選自由核苷酸、核苷酸衍生物、NaCl、KCl、 MgCl2、牛血清白蛋白和金屬離子螯合劑所組成的組中的一種或多種，優(yōu)選的，為了獲得最 佳的穩(wěn)定效果，所述穩(wěn)定劑選自核苷酸和核苷酸衍生物中的至少一種。
[0025] 其中，所述核苷酸和核苷酸衍生物為腺苷酸、鳥苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核 苷酸、腺苷5'-二磷酸鈉鹽、腺苷5'-二磷酸鉀鹽、腺苷-3'，5'-環(huán)單磷酸鈉鹽、鳥 苷-3' ,5'-環(huán)單磷酸鈉鹽、鳥嘌呤核苷_5'_二磷酸二鈉、胞嘧啶核苷酸二鈉、尿苷二磷 酸二鈉等。
[0026] 其中，所述金屬離子螯合劑為EDTA. 2Na和EDTA. 2K中的至少一種。
[0027] 可選的，在所述復合試劑中，還原型輔酶的濃度為0. 01-10g/L，優(yōu)選為0. 5_6g/L; 緩沖液的終濃度為5-500mmol/L，優(yōu)選為10-100mm〇l/L;穩(wěn)定劑的濃度為0. 5-20g/L，優(yōu)選 為 3-10g/L。
[0028] 其中，所述緩沖液的終濃度表示利用緩沖液、還原型輔酶和穩(wěn)定劑等組分配制所 述復合試劑后，復合試劑中起緩沖作用的有效成分的終濃度，例如，當所述緩沖液為N-三 (羥甲基）-3_氨基丙烷磺酸（TAPS)時，緩沖液的終濃度表示配制獲得的復合試劑中N-三 (羥甲基）-3_氨基丙烷磺酸（TAPS)的濃度。當緩沖液由兩種或兩種以上有效成分組成時， 緩沖液的終濃度指代幾種有效成分的總濃度。
[0029] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，所述緩沖液為N-三（羥甲基）-3_氨基丙烷 磺酸（TAPS)或3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸（TAPSO)，所述穩(wěn)定劑為腺苷-3'，5'-環(huán) 單磷酸鈉鹽和鳥苷-3'