一種綿羊低氧適應(yīng)性的快速篩選方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用分子標(biāo)記預(yù)測(cè)綿羊低氧適應(yīng)性，并用于引種 和育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在我國(guó)面積最大的青藏高原牧區(qū)約有20億畝可利用的高寒草場(chǎng)，其中綿羊業(yè)是 當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的主要部門。目前，青藏高原的大部分綿羊?yàn)椴叵稻d羊，生長(zhǎng)速度慢、產(chǎn)肉性能 極低、繁殖力弱。而高原特有的高寒低氧環(huán)境造成引進(jìn)的優(yōu)良品種或者引進(jìn)品種與當(dāng)?shù)仄?種的雜交后代很難適應(yīng)高寒低氧環(huán)境。找到一種合適的方法，篩選適應(yīng)高原低氧環(huán)境的綿 羊品種或者雜交個(gè)體，將大大提高引種和進(jìn)一步雜交選育的效率。
[0003] 在高原適應(yīng)的各種因素中，血紅蛋白（Hemoglobin,HB)在動(dòng)物體內(nèi)擔(dān)負(fù)著運(yùn)送 氧氣和二氧化碳的重要生理功能，與高原動(dòng)物的低氧適應(yīng)性直接相關(guān)。1955年Harris和 Warren用紙層析電泳測(cè)定出綿羊HB存在HBA和HBB兩種變異體，他們把pH5. 6時(shí)向陽(yáng)極 泳動(dòng)得快的HB區(qū)帶稱為HBA，把泳動(dòng)得慢者稱為HBB(HARRISandWARREN1955)。從表 型上，Dawson等（DAWSONandEVANS1967)進(jìn)行的綿羊低氧耐力試驗(yàn)，證明具有HBA的綿 羊具比有HBB的綿羊具有更強(qiáng)的低氧耐受力。群體調(diào)查也顯示英國(guó)山地綿羊以HBA占優(yōu) 勢(shì)，低地綿羊以HBB為顯著，前者對(duì)高海拔和低營(yíng)養(yǎng)的飼料有較好的適應(yīng)性（MANWELLand BAKER1970)。HBA低氧適應(yīng)的機(jī)理是其具有更高的氧親和力，這在包括藏羊的多個(gè)綿羊品種 中都已經(jīng)被證明（HUISMANandKITCHENS1968;VANVLIETandHUISMAN1964 ;周虞爛and 劉國(guó)富1985)。在我國(guó)藏綿羊群體基因組研究中發(fā)現(xiàn)，歐拉型藏綿羊HB的HBA基因型為優(yōu) 勢(shì)基因型，是對(duì)高原缺氧環(huán)境的適應(yīng)（信金偉etal. 2007)。藏羊的HBA基因頻率會(huì)隨著 海拔高度上升發(fā)生敏銳而有規(guī)律變化（張才駿etal. 1993 ;張才駿etal. 1988 ;張才駿et al. 1987)。以上研究結(jié)果都證明了HBA和高原低氧適應(yīng)性直接相關(guān)，高頻率的HBA也是藏 羊能在其他品種綿羊不能適應(yīng)與生存的高海拔地區(qū)健康生息和繁衍后代的重要原因之一。
[0004] 因?yàn)樯鲜鼍d羊血紅蛋白多態(tài)性對(duì)高原低氧適應(yīng)性的關(guān)系，通過(guò)選育提高種群的 HBA基因頻率，是青藏高原藏綿羊育種的重要方向。然而從1955年至今為止，區(qū)分綿羊HBB 和HBA的蛋白的方法并無(wú)實(shí)質(zhì)改進(jìn)，仍是利用蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸組成的微細(xì)差異，在 電泳模式上表現(xiàn)出差別。如紙層析或聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（PAGE)。蛋白樣品的提 取，保存和電泳均需要較高的條件。另外，蛋白鑒定需要的樣品量較大，該方法僅可在羊出 生后再鑒別血紅蛋白類型。目前體外受精和胚胎移植技術(shù)已經(jīng)非常成熟并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于 新品種的引種和繁殖。然而受體羊的選擇、超數(shù)排卵、孕期管理和生產(chǎn)都有較高的經(jīng)濟(jì)和時(shí) 間成本。出生后再鑒定，拋棄基因型不合適的羊羔，會(huì)造成很大的浪費(fèi)。以上原因?qū)е履壳?基于蛋白電泳的檢測(cè)方法對(duì)樣品、技術(shù)、成本的要求都很高。
[0005] DNA的提取、保存和電泳均易于蛋白質(zhì)，目前對(duì)HBA和HBB在基因組上的的結(jié)構(gòu)差 異已經(jīng)研究清楚。HBA和HBB在基因組上的差異是由兩種不同的單倍型（A型和B型）造成 的。A單倍型由0血紅蛋白家族的12個(gè)同源基因或假基因組成，B單倍型只包括其中的八 個(gè)基因或假基因，尤其是B單倍型中不包括Pe基因。所以從結(jié)構(gòu)上，B單倍型相對(duì)與A單 倍型有四個(gè)基因長(zhǎng)度約30kb的缺失，從功能上，0 ￡基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的氧親和力較高，造成含 有0￡的單倍型低氧耐受力強(qiáng)（Garner&Lingrel1988)。
[0006] 雖然HBA和HBB基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系已經(jīng)被廣泛的接受，然而目前分子生物學(xué) 上對(duì)大片段插入/缺失的檢測(cè)缺乏有效手段。理論上可用的檢測(cè)方法有：全基因組測(cè)序、 Southern印記雜交、免疫熒光原位雜交（FISH)還有近年來(lái)發(fā)展的長(zhǎng)片段PCR技術(shù)和多重連 接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLAP)。這些檢測(cè)方法對(duì)樣品、技術(shù)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)成本的需要甚至高于蛋白 電泳，所以僅限于實(shí)驗(yàn)研究，并未在生產(chǎn)中被用于HB分型。另外直接通過(guò)該基因簇中基因 序列（如Pe)的差異檢測(cè)HBA也比較困難，原因是該區(qū)域是由多個(gè)高同源性的基因家族組 成的基因簇，很難設(shè)計(jì)出特異引物。同時(shí)，目前也并無(wú)與HBA連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)通過(guò)蛋白電泳對(duì)綿羊HB分型要求樣品量大、技術(shù)困難、成本高的不足，本發(fā) 明提供一種基于基因組多態(tài)性的綿羊低氧適應(yīng)性的快速篩選方法及其應(yīng)用，從而提高綿羊 高原低氧適應(yīng)性的預(yù)測(cè)速度，加快輔助引種和育種過(guò)程。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0009] 一種綿羊低氧適應(yīng)性的快速篩選方法，包括以下步驟：
[0010] 1)提取被檢測(cè)綿羊的基因組DNA;
[0011] 2)根據(jù)存在于綿羊參考基因組3. 1版本中15號(hào)染色體上47. 52~47. 56Mb區(qū)域 的序列多態(tài)性，對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行基因分型；在所述區(qū)域，存在A型和B型兩種單倍型， B型相對(duì)于A型存在片段缺失；或者，根據(jù)定位于所述區(qū)域內(nèi)的分子標(biāo)記位點(diǎn)或根據(jù)定位于 所述區(qū)域兩側(cè)的緊密連鎖的分子標(biāo)記位點(diǎn)，對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行基因分型。
[0012] 根據(jù)基因分型結(jié)果，對(duì)具有A型序列特征的被測(cè)綿羊或者根據(jù)分子標(biāo)記位點(diǎn)的單 倍型預(yù)測(cè)具有A型序列特征的被測(cè)綿羊進(jìn)行血紅蛋白分型檢測(cè)，從而篩選出低氧適應(yīng)性較 高的綿羊個(gè)體。
[0013] 所述A型的序列長(zhǎng)度為70356bp，B型的序列長(zhǎng)度為40001bp。所述A型的序列 如SEQ.ID.NO. 1所示，B型的序列如綿羊參考基因組3. 1版本中15號(hào)染色體上47. 52~ 47. 56Mb區(qū)域的序列所示。所述分子標(biāo)記位點(diǎn)定位于所述區(qū)域兩側(cè)47. 50~47. 52Mb以及 47. 56~47. 59Mb的區(qū)域內(nèi)。
[0014] 所述分子標(biāo)記位點(diǎn)為SNP位點(diǎn)。
[0015] 上述綿羊低氧適應(yīng)性的快速篩選方法在低氧適應(yīng)性綿羊輔助引種、雜交選育中的 應(yīng)用。上述綿羊低氧適應(yīng)性的快速篩選方法在高原適應(yīng)性綿羊引種和品種選育中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：
[0017] 本發(fā)明主要利用非編碼區(qū)及基因間區(qū)中的多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)血紅蛋白類型進(jìn)行預(yù)測(cè)， 與編碼區(qū)序列相比，基因間區(qū)所受的選擇壓力較低，序列多態(tài)性較高，同源性較小，容易設(shè) 計(jì)出特異引物或探針。
[0018] 本發(fā)明提供的A型序列（參見(jiàn)SEQ.ID.NO. 1)與B型相比，除B型具有約30kb缺 失之外，在同源區(qū)與B型之間的差異高達(dá)13%。且該遺傳標(biāo)記序列絕大部分位于基因間區(qū)， 與其他基因家族成員保守性較小，容易設(shè)計(jì)出特異性引物和探針區(qū)分。利用該多態(tài)性區(qū)域 及周圍緊密連鎖的分子標(biāo)記為點(diǎn)，例如SNP位點(diǎn)，可以用簡(jiǎn)便基因分型方法預(yù)測(cè)綿羊血紅 蛋白類型。經(jīng)過(guò)實(shí)測(cè)，本發(fā)明提供的單個(gè)分子標(biāo)記預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率均達(dá)到80 %以上。
[0019] 另外，因?yàn)镈NA的提取、保存和電泳均易于蛋白質(zhì)，本發(fā)明僅需少量甚至單細(xì)胞樣 品就能進(jìn)行檢測(cè)，可以應(yīng)用于胚胎植入前階段的基因型篩查，快速選出HBA型的胚胎進(jìn)行 移植。與出生后再進(jìn)行檢測(cè)，拋棄羊羔相比，節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。同時(shí)無(wú)需對(duì)所有綿羊 個(gè)體一一進(jìn)行蛋白電泳分型，也可用于快速篩選低氧適應(yīng)性較強(qiáng)的HBA成年綿羊品種或個(gè) 體，有利于加快高原綿羊的引種和育種。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明提供的血紅蛋白P基因簇的A型長(zhǎng)單倍型特異序