水泡性口炎病毒和/或豬水泡病病毒的基因芯片以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水泡性口炎病毒和/或豬水泡病病毒的基因芯片以及檢測(cè) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水泡性口炎（Vesicularstomatitis,VS)和豬水泡?。⊿winevesicular disease,SVD)分別是由水泡性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus,VSV)和豬水泡病 病毒（Swinevesiculardiseasevirus,SVDV)引起的哺乳動(dòng)物的急性、高度接觸性傳染 病，這兩種類(lèi)型的病毒都可以感染豬，發(fā)病率極高，并能夠形成大范圍的流行，能引起嚴(yán)重 的公共衛(wèi)生問(wèn)題，均被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病。這兩種疾病均以 豬舌、唇、口腔黏膜、乳頭和蹄冠等處上皮發(fā)生水皰為主要癥狀，因此在臨床癥狀上無(wú)法對(duì) 這三兩疾病進(jìn)行區(qū)分，必須通過(guò)病原學(xué)進(jìn)行鑒別診斷。
[0003]目前，對(duì)這兩種疾病的診斷多采用分離鑒定及常規(guī)的血清學(xué)方法，所需時(shí)間較長(zhǎng)， 也有PCR技術(shù)的鑒別方法，但還沒(méi)有建立操作性強(qiáng)且能同時(shí)鑒別兩種病毒的方法。因此，有 必要建立能同時(shí)進(jìn)行兩種疫病快速檢測(cè)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、可同時(shí)檢測(cè)水泡性口 炎病毒和豬水泡病病毒的基因芯片和試劑盒。
[0005] 基因芯片，是指指通過(guò)不同方法將生物分子（寡核苷酸、CDNA、gen〇miCDNA、多肽、 抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的 生物分子點(diǎn)陣，其突出的特點(diǎn)是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本發(fā)明檢測(cè)水泡性口炎病毒和/或豬水泡病病毒的基因芯片，它包括固相載體以 及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQIDNO:1~2所示基因片段，用于檢測(cè)水泡 性口炎病毒和/或豬水泡病病毒。
[0007] 其中，它還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQIDNO:7~8所示。
[0008] 本發(fā)明檢測(cè)水泡性口炎病毒和/或豬水泡病病毒的試劑盒，它包括前述的基因芯 片以及擴(kuò)增試劑；其中，擴(kuò)增試劑包括SEQIDNO:3~4、SEQIDNO:5~6所示引物對(duì)，用 于擴(kuò)增水泡性口炎病毒和/或豬水泡病病毒。
[0009] 其中，所述引物對(duì)中，上游引物與下游引物的摩爾比為1:1。
[0010] 其中，所述SEQIDNO:3、5所示上游引物標(biāo)記有熒光染料。
[0011] 本發(fā)明還提供了SEQIDNO:1~2所示基因片段在制備檢測(cè)水泡性口炎病毒和 /或豬水泡病病毒的基因芯片的用途。
[0012] 其中，所述基因芯片還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQIDNO:7~8所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了SEQIDNO:3~4、SEQIDNO:5~6所示引物對(duì)以及SEQIDNO: 1~2所示基因片段在制備檢測(cè)水泡性口炎病毒和/或豬水泡病病毒的試劑盒中的用途； 其中，引物對(duì)為擴(kuò)增試劑，SEQIDNO:1~2所示基因片段為檢測(cè)探針。
[0014] 本發(fā)明基因芯片和試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)、水泡性口炎病毒和豬水泡病病毒，特異 性強(qiáng)，靈敏度高耗時(shí)短，檢測(cè)快速，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情況臨床應(yīng)用前景良好。
[0015] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書(shū)記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1芯片矩陣設(shè)計(jì)
[0017] 圖2水化溫度優(yōu)化
[0018]圖3封閉液配比優(yōu)化。1:0? 5%BH4Na, 25%Ethanol;2: 0? 25%BH4Na, 25% Ethanol;3:0%BH4Na, 25%Ethanol;4:0. 5%BH4Na, 15%Ethanol;5:0. 25%BH4Na, 15% Ethanol；: 0 %BH4Na, 15%EthanoI；7:0. 5 %BH4Na, 0%Ethanol；8:0. 25 %BH4Na, 0% Ethanol；9:0%BH4Na,0%Ethanol.
[0019] 圖4探針篩選矩陣設(shè)計(jì)
[0020] 圖5水泡性口炎探針篩選
[0021] 圖6豬水泡病探針篩選
[0022] 圖 7 水泡性口炎芯片靈敏度。A: 10-5 ;B:10-6 ;C: 10-7 ;D:10-8.
[0023] 圖 8 豬水泡病芯片靈敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0024] 圖9水泡性口炎引物的特異性實(shí)驗(yàn)。1:VSV;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A;4:FMDV-AsiaI; 5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV； 10!Negativecontrol
[0025] 圖10豬水泡病引物的特異性實(shí)驗(yàn)。1:SVDV;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A;4:FMDV-AsiaI; 5:VSV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV； 10!Negativecontrol
[0026] 圖11水泡性口炎不同廠家芯片檢測(cè)比對(duì)。A:上海百傲科技有限公司BaiO?l醛基基 片；B:北京博奧生物有限公司晶芯_醛基基片
[0027] 圖12豬水泡病不同廠家芯片檢測(cè)比對(duì)。A:上海百傲科技有限公司BdO?醛基基 片；B:北京博奧生物有限公司晶芯》醛基基片
【具體實(shí)施方式】
[0028] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0029] I. 1材料試劑：
[0030]

[0033] I. 3實(shí)驗(yàn)試劑的配制
[0034] 引物稀釋?zhuān)焊鶕?jù)合成單，將合成的引物干粉加入適量滅菌超純水，制成100yM的 引物貯存液，使用時(shí)按照1 :4(引物貯存液：滅菌超純水）的體積比將其稀釋成20yM的引 物使用液；
[0035] 10g/L瓊脂糖凝膠：稱(chēng)取Ig瓊脂糖凝膠，加入IOOmLlXTAE電泳緩沖液中，微波爐 加熱3min，溶解完全后加入lOmg/mL的EB5yL，震蕩混勾，倒入膠槽內(nèi)，待凝固后點(diǎn)樣；
[0036] 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，稱(chēng)取所需質(zhì)量的培養(yǎng)基干粉于三角錐瓶?jī)?nèi)，加 入相應(yīng)比例的去離子水，121°C滅菌20min，備用；
[0037] 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，稱(chēng)取所需質(zhì)量的培養(yǎng)基干粉于三角錐瓶?jī)?nèi)，加 入相應(yīng)比例的去離子水，121 °C滅菌20min，備用。
[0038] 20XSSC:稱(chēng)取NaCl，175. 2g，檸檬酸三鈉，21120，100. 5g，溶解于少量mini-Q超純 水中，用5MHCl調(diào)pH至7. 0,最后用Mini-Q雙蒸水定容到IL;
[0039] 10XPBS:按mol數(shù)/IL含 1370mMNaCl，270mMKC1，IOlmMNa2HP04,18mMKH2P04; 按g數(shù)/IL含NaCl，80g，KCl，2g，Na2HP04 ? 12H20, 35. 8g，KH2P04, 2. 7g，溶于 800mL蒸餾水 中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4,加蒸餾水定容至IL;
[0040] 10%SDS:稱(chēng)取SDS100g，溶于 900mLMini-Q水中。
[0041] 雜交后洗液I:SSC終濃度為2X，SDS終濃度為0.2%，若10%SDS產(chǎn)生白色絮狀 沉淀，請(qǐng)置于42°C水浴中溶解混勻后配制洗液。
[0042] 雜交后洗液II:SSC終濃度為0?2X。
[0043] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測(cè)方法
[0044] 1、材料和儀器
[0045] 同前述實(shí)驗(yàn)材料和儀器。
[0046] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0047] 2. IPCR引物、檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)與合成
[0048] 2.I. 1引物設(shè)計(jì)：
[0049] 根據(jù)NCBI公布的VSV序列以及SVDV序列，在充分比較同源性的基礎(chǔ)上，選取保守 區(qū)用軟件PrimerPrimer5. 0軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行BLAST序列比對(duì)初步驗(yàn)證引物特異性。 本研究所用引物詳見(jiàn)表1，每對(duì)引物的上游引的5'端均連接有一個(gè)Cy3熒光基團(tuán)。所有引 物由生工生物工程（上海）公司合成。
[0050] 表1引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小
[0051]
[0052] 2. 1. 2探針設(shè)計(jì)：
[0053] 根據(jù)2.I. 1所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增區(qū)段，使用PrimerPrimer5. 0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)VSV以 及SVDV的特異性探針，每種目的片段設(shè)計(jì)多條探針，以備篩選。芯片探針序列及修飾方 法：每條探針的5'端均通過(guò)15個(gè)胸腺嘧啶核苷酸連接有一個(gè)氨基。前者的作用是使探 針在固相支持物一一玻璃片上充分伸展開(kāi)，后者的作用是與醛基修飾的玻璃片進(jìn)行縮合反 應(yīng)，以固定在玻片上。使用一段隨機(jī)序列作為位置質(zhì)控（Positioncontrol,PC)，其5'端 連接有一個(gè)氨基，3'端連接一個(gè)Cy3熒光基團(tuán)；使用一段隨機(jī)序列作為雜交質(zhì)控（Hybrid control，HC)其5'端連接有一個(gè)Cy3熒光基團(tuán)，并使用它的互補(bǔ)序列作為雜交質(zhì)控探針 (Hybridcontrol-probe,HC-p)其5'端同樣通過(guò)15個(gè)胸腺啼啶核苷酸連接有一個(gè)氨基。 檢測(cè)探針序列具體如表2,質(zhì)控序列如表3。
[0054] 表2檢測(cè)探針序列
[0055]
[0056] 表3質(zhì)控序列
[0057]
[0058] PC(PositionControl位置質(zhì)控）、HC(Hybridcontrol雜交質(zhì)控）、HC_p(HC_p本 身不發(fā)光，只有當(dāng)HC與HC-p結(jié)合后該位點(diǎn)才會(huì)發(fā)光）（HC-p(Hybridcontrol-probe雜交 質(zhì)控探針）
[0059] 2. 2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0060] 病毒基因組RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0061] 按照寶生物（大連）有限公司的病毒RNA/DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA模 板。
[0062] 病毒目的基因的克隆、測(cè)序分析
[0063] ①以反轉(zhuǎn)錄的病毒cDNA為模板，分別使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0064] PCR體系
[0065]
[0066] ②根據(jù)膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)，膠回收FMDV-〇/A/AsiaI、VSV及SVDV擴(kuò)增的PCR產(chǎn) 物，40yLElutionBuffer溶解。
[0067] ③根據(jù)pMD19-T載體連接試劑盒說(shuō)明書(shū)，按照如下體系把膠回收的DNA片段連接 于pMD19-T載體上。
[0068] 連接體系：
[0069]
[0070] ④將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dH5a感受態(tài)細(xì)胞中，1)冰上融化感受態(tài)細(xì)胞；2)加入連接 后的質(zhì)粒，冰上放置40min，42°C水浴90s，置于冰上，備用；3)加800yL無(wú)Amp的營(yíng)養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)基，37°C搖床震蕩培養(yǎng)40min~60min;4)培養(yǎng)液在5000rpm離心3min，棄上清800yL， 混勾，取50yL涂含Amp(50yg/mL)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37°C恒溫箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
[0071] ⑤次日，挑取轉(zhuǎn)化的dH5a-pMD19T-VSV&SVDV單菌落，接入含Amp(50yg/mL)的營(yíng) 養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中，37°C，170rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
[0072] ⑥次日，取3mL經(jīng)上述培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒，操作步驟見(jiàn)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。 提取質(zhì)粒DNA用80yLElutionBuffer洗脫，1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳條件：100V， 25min，上樣 3yL。
[0073] ⑦提取質(zhì)粒利用如前所述的體系、條件進(jìn)行鑒定，模板體積為IyL，PCR產(chǎn)物進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件：1〇(^，251^