實(shí)例的又一方面在于該單鏈 胰島素類似物保持經(jīng)受類似于本領(lǐng)域已知的經(jīng)典鋅胰島素六聚物如TJ夷島素六聚物、T 3Rf3 胰島素六聚物或RJ夷島素六聚物的蛋白質(zhì)六聚物的鋅離子依賴性形成的能力。
[0028] 還可以預(yù)想，單鏈類似物還可以由衍生自動物胰島素(如作為非限制性實(shí)例的豬、 牛、馬和犬胰島素）的A-和B結(jié)構(gòu)域序列制成。此外或替代地，本發(fā)明的胰島素類似物可 以含有殘基B1-B3的缺失或可以與缺乏賴氨酸的變體B鏈結(jié)合(例如野生型人胰島素中 的Ly sB29 )以避免在畢赤氏巴斯德酵母（/3ZcAia /Λ361 ioris)、釀酒酵母（ cereKisciae)或其它酵母表達(dá)物種或菌株中的酵母生物合成中前體多肽的Lys定向蛋白 酶解。本發(fā)明的單鏈胰島素的B結(jié)構(gòu)域可以任選含有意在提高熱力學(xué)穩(wěn)定性和受體-結(jié) 合活性的其它置換。還可以設(shè)想，在C結(jié)構(gòu)域中的Thr B27、ThrB3°或一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基 可以單獨(dú)或組合地被單糖加合物修飾；實(shí)例由0-連接的N-乙?；?β -D-半乳糖苷(稱為 GalNAc-O β -Ser或GalNAc-O β -Thr)、〇-連接的a -D-吡喃甘露糖苷(甘露糖-0 β -Ser或 甘露糖-0 β -Thr)和/或a -D-吡喃葡萄糖苷(葡萄糖-0 β -Ser或葡萄糖-0 β -Thr)提供。
[0029] 此外，考慮到人胰島素與動物胰島素之間的相似性，以及過去在患有糖尿病的患 者中使用動物胰島素，還可以設(shè)想在胰島素的序列中引入其它小的修飾，尤其是被認(rèn)為"保 守"的那些置換。例如，可以在具有類似側(cè)鏈的氨基酸組中進(jìn)行氨基酸的額外置換而不偏離 本發(fā)明。這些包括中性疏水性氨基酸：丙氨酸（Ala或Α)、纈氨酸（Val或V)、亮氨酸（Leu或 L)、異亮氨酸（lie或I)、脯氨酸（Pro或P)、色氨酸（Trp或W)、苯丙氨酸（Phe或F)和蛋氨 酸（Met或M)。同樣，中性極性氨基酸可以在它們的甘氨酸（Gly或G)、絲氨酸（Ser或S)、 蘇氨酸（Thr或T)、酪氨酸（Tyr或Y)、半胱氨酸（Cys或C)、谷氨酰胺（Glu或Q)和天冬酰胺 (Asn或N)的組中互相置換。堿性氨基酸被認(rèn)為包括賴氨酸（Lys或K)、精氨酸（Arg或R) 和組氨酸（His或H)。酸性氨基酸是天冬氨酸（Asp或D)和谷氨酸（Glu或E)。除非另行指 出或由上下文顯而易見，本文中提到的氨基酸應(yīng)認(rèn)為是L-氨基酸。標(biāo)準(zhǔn)氨基酸也可以被屬 于同一化學(xué)種類的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸置換。作為非限制性實(shí)例，堿性側(cè)鏈Lys可以被側(cè)鏈長度 較短的堿性氨基酸(鳥氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸）取代。Lys還可以被中性脂族等排 正亮氨酸（Nle)取代，其進(jìn)而被含有更短的脂族側(cè)鏈的類似物(氨基丁酸或氨基丙酸)置換。
[0030] 出于比較目的提供人胰島素原的氨基酸序列作為SEQ ID N0:1。
[0031] SEQ ID NO :1 (人胰島素原）
其中Xaa1表示His、Arg、Lys或Orn ;并且其中Xaa 2是Lys、Arg或Orn ;并且其中Xaa 3 是 Gly、Ala 或 SerD
[0037] SEQ ID NO ：7
類似的合成基因已經(jīng)在編碼SCI-59A (參見下文）和含有額外置換GluB13- Gln的 SCI-59A和SCI-59B的衍生物的畢赤氏巴斯德酵母中制備和克隆。
[0043] 本發(fā)明的兩種單鏈胰島素類似物(稱為SCI-59A和SCI-59B)通過在畢赤氏巴斯德 酵母中生物合成前體多肽來制備；該系統(tǒng)分泌含有天然二硫鍵和裂解N-末端延長肽的折 疊蛋白質(zhì)。該裂解的單鏈胰島素產(chǎn)品具有59的長度一一30個(gè)殘基的B結(jié)構(gòu)域、8個(gè)殘基的 C結(jié)構(gòu)域和21個(gè)殘基的A結(jié)構(gòu)域之和。該C結(jié)構(gòu)域序列在各種情況下為EE6SRRSR(SEQ ID NO: 14)，其中引入酸性元素(位置Cl和C2 ;粗體）以削弱對IGF-IR的結(jié)合，引入Gly (位 置C3 ;斜體）作為柔性接頭，以及IGF-II C-結(jié)構(gòu)域衍生元素(在本類似物中的位置C4-C8 ; 下劃線）。SCI-59A 含有額外置換 ThrAS- His、Asn A21- Gly 和 Lys B29- Arg，而 SCI-59B 含 有額外置換 ThrAS- Arg、Asn A21- Gly 和 Lys B29- Arg (SEQ ID NO: 7)。SCI-59A 的形式 等電點(diǎn)（pi)被預(yù)測通過C結(jié)構(gòu)域序列(三個(gè)額外精氨酸殘基被兩個(gè)額外谷氨酸殘基部分抵 消）和位置A8處的額外的可滴定組氨酸的組合效果而朝向中性移動；B29處的Lys的Arg 置換預(yù)期對等電點(diǎn)的效果可忽略不計(jì)。SCI-59B的形式pi被預(yù)測通過C結(jié)構(gòu)域序列(如在 SCI-59A中那樣，三個(gè)額外精氨酸殘基被兩個(gè)額外谷氨酸殘基部分抵消）和位置A8處的額 外Arg的組合效果而進(jìn)一步朝向中性移動。
[0044] 表1.體外受體-結(jié)合親和力
縮寫：IR_B，胰島素受體的剪接同種型B ;IGF-1R，1型IGF受體。
[0045] 表1包含SCI-59A和SCI-59B相對于野生型人胰島素的受體-結(jié)合親和力。圖2 中提供了代表性數(shù)據(jù)。這兩種單鏈類似物各自表現(xiàn)出相對于野生型胰島素對IGF-IR極低 的交叉結(jié)合。（相對活性定義為類似物對野生型人胰島素的激素-受體解離常數(shù)的比，如通 過使用 125I-人胰島素的競爭性置換試驗(yàn)測定。）SCI-59B表現(xiàn)出具有類似于野生型胰島素 的比例的在5-100%的目標(biāo)范圍內(nèi)的對IR-A和IR-B的相對親和力。相反，SCI-59A (在位 置A8處不同）的IR-A和IR-B的親和力各自低于SCI-59B。而SCI-59A對IR-A的親和力 在目標(biāo)范圍內(nèi)（約10%)，其對IR-B的親和力在目標(biāo)范圍底部(實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)5%)，獲得了相對 于野生型胰島素提高的IR-A/IR-B結(jié)合比。這些發(fā)現(xiàn)表明，在接頭EEGSRRSR (SEQ ID NO: 14)的情況下在位置A8處Arg優(yōu)于His。SCI-59B的預(yù)測pi也比SCI-59A更接近于甘精胰 島素(其同樣含有額外的兩個(gè)精氨酸殘基）的pi。
[0046] 受體-結(jié)合活性的測定步驟如下。微量滴定條帶板（Nunc Maxisorb)在4°C下用 AU5 IgG (100微升/孔，40毫克/毫升在磷酸鹽緩沖的鹽水中）孵育整夜。通過雙位點(diǎn)順 序模型分析結(jié)合數(shù)據(jù)。對非特異性結(jié)合校正數(shù)據(jù)(在1 μ M人胰島素存在下相關(guān)的膜殘留 放射性的量)。在所有測定中，在不存在競爭性配體情況下結(jié)合的示蹤劑的百分比小于15% 以避免配體消耗的假象。如Whittaker和Whittaker所述那樣通過擬合至數(shù)學(xué)模型來確定 解離常數(shù)（K d) (2005. 280: 20932-20936);該模型采用假設(shè)異源競爭的 非線性回歸（Wang, 1995，360: 111-114)。
[0047] 考慮到其更高的受體結(jié)合親和力和更有利的預(yù)測的等電點(diǎn)，結(jié)構(gòu)與生物研究集中 于SCI-59B。2D-NMR NOESY譜提供了折疊結(jié)構(gòu)的證據(jù)（圖3) ;NOEs的圖案和化學(xué)位移符合 57個(gè)殘基的單鏈胰島素類似物的現(xiàn)有分析（Hua，Q. X.等人（2008))。
[0048] 為了評估該類似物在動物模型中的生物活性和效力，通過用鏈脲霉素（STZ)處 理令雄性Sprague-Dawley大鼠（平均體重~300克）患上糖尿病。蛋白質(zhì)溶液含有KP-胰 島素(賴脯胰島素，Humalog?的活性成分；Eli Lilly and Co·)、甘精胰島素 （Lantus 3&11〇打4代1^&)和/或本發(fā)明的單鏈胰島素。通過注射由16毫克甘油、1.6毫克間甲 酚、0. 65毫克苯酚和3. 8毫克磷酸鈉 pH 7. 4組成的不含蛋白質(zhì)的Lilly稀釋劑(獲自Eli Lilly and Co.)來提供對照物。如圖4中所示，相對于Humulog? (取自未到期的商品小瓶 的U-100強(qiáng)度）和Lantus? (取自未到期的商品小瓶的U-100強(qiáng)度）評價(jià)SCI-59B的活性。 根據(jù)Lantus?中甘精胰島素的配方配制SCI-57B，除了 pH調(diào)節(jié)為3. 5 (而不是pH 4. 0)。這 些制劑各自的一個(gè)單位皮下注射，通過使用臨床血糖儀（Hypoguard Advance Micro-Draw 計(jì)）的連續(xù)測量監(jiān)控血糖濃度方面的所得變化。以五個(gè)成員為一組（N=5)在時(shí)間t=0時(shí)對 大鼠進(jìn)行皮下注射。在時(shí)間〇和每10分鐘直至360分鐘從尾巴的剃毛末端獲得血液。在 類似于Lantus?的配制條件下，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的SCI-59B保留了相當(dāng)一部分甘精胰島素的生 物活性，并具有類似于或大于Lantus?的作用持續(xù)時(shí)間。
[0049] 合成 59 聚體 SCI，具有置換 Arg' GlyA21、ArgB29并具有接頭 EEGRSSSR (SEQ ID NO: 7)。這種SCI稱為Thermalin-basal或在圖5中縮寫為T-b。在25°C和pH 4. 0下通過 CD-監(jiān)控的胍變性來評價(jià)熱力學(xué)穩(wěn)定性。通過應(yīng)用二態(tài)模型獲得3. 5(±0. 1)千卡/摩爾的 伸展自由能（A Gu)，這高于這些條件下甘精胰島素的穩(wěn)定性（2. 7 (±0. 1)千卡/摩爾）。自 由能的這種提高（Δ AGu 0.7(±0. 2)千卡/摩爾）明顯預(yù)測了提高的化學(xué)穩(wěn)定性。
[0050] 相對于甘精胰島素通過在37°C與45°C下和pH 4.0下的U-100制劑中柔和攪拌 來探測對纖維化的抗性。然而在37 °C下在10天后和在45 °C下在5天后Lantus沉淀， Thermalin-basal的溶液保持澄清，并且硫磺素 T (淀粉樣蛋白的探針）的熒光并未增強(qiáng)。
[0051] 在通過鏈脲霉素產(chǎn)生糖尿病的Sprague-Dawley大鼠（約300克）中測試效力（圖 5A 和 5B)。在皮下注射 U-100 (0· 6 mM)Thermalin_basal 或 Lantus? (每只大鼠 1 單位；在 Thermalin-basal 組（▲)中 N=5,在 Lantus?組（?)中 N=10)，所獲得的血糖濃度（AUC)的 降低與恢復(fù)表明Thermalin-basal的效力類似于或大于Lantus