Nod1蛋白抑制多肽及其應用
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及用于預防和治療或預防類風濕性關節(jié)炎的多肽。
【背景技術】：
[0002] 類風濕關節(jié)炎的病因和發(fā)病機制尚未完全明了，主要是機體對自身免疫系統(tǒng)的免 疫應答，引起的炎性關節(jié)炎。以慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)， 屬于自身免疫炎性疾病。其基本病理特點是血管炎和滑膜炎。關節(jié)內滑膜血管增生，形成 血管翳，導致滑膜增厚，滲出增多，分泌多種細胞因子，侵犯軟骨并引起骨質損害。對其周圍 的肌腔、韌帶、腱鞘以及肌肉等組織也均可侵蝕，從而影響關節(jié)的穩(wěn)定，容易發(fā)生關節(jié)畸形 而出現(xiàn)功能障礙。
[0003] 核苷酸結合寡聚化結構域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain like receptors，NOD-Iike receptors，NLR)家族是近年發(fā)現(xiàn)的細胞質內的模式識 別受體（pattern recognitionreceptors，PRR) JLR家族的分子結構在進化中高度保守，在 宿主防御中也發(fā)揮著重要作用并且可與Toll樣受體（Tolllike receptors，TLR)蛋白家族 的免疫防御功能互補。在哺乳動物中NLR家族有20多個成員，盡管這些受體的配體及其功 能尚不清楚，但它們的主要作用在于識別胞質內病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP)，從而誘導免疫應答。
[0004] 其中，NODl (又名CARD4)是NLR族中最早發(fā)現(xiàn)的細胞內PRR之一。NODl的蛋白 為胞漿內模式識別受體，能識別進入胞內的細菌胞壁及其降解產(chǎn)物的致病特性，發(fā)出警報， 向RIP2等其他的蛋白發(fā)送信號，告知細胞處于危險之中。最終，這一信號傳導到NF- κ B蛋 白，這一轉錄因子會指示基因組啟動一種免疫反應，激活與炎癥、中性粒細胞和其他免疫功 能相關的基因。而NF- κ B蛋白，與類風濕關節(jié)炎中炎癥的發(fā)生，軟骨損傷，細胞迀移以及血 管翳的形成都有重要的關系。NODl蛋白成為對抗類風濕關節(jié)炎的新靶點。盡管如此，并沒 有成熟開發(fā)的NODl蛋白多肽抑制多肽問世，用于治療RA。

【發(fā)明內容】
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[0005] 本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有治療類風濕關節(jié)炎的特點，設計一種NODl蛋白抑制多肽， 可以用于治療或預防類風濕關節(jié)炎。
[0006] 本發(fā)明技術方案是提供一種NODl蛋白抑制多肽，其序列為MKNMWKSARKIDAFQHM， 及在治療或預防類風濕性關節(jié)炎藥物中的應用。其用途可通過多種給藥方式治療和預防類 風濕關節(jié)炎疾病，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥丸、膠囊等， 鼻噴劑等。
[0007] 有益結果：
[0008] 本發(fā)明中的NODl蛋白抑制多肽序列MKNMWKSARKIDAFQHM，可以靶向抑制NODl蛋 白，抑制NODl蛋白受體產(chǎn)生的生理或病理的效應，達到預防或治療類風濕性關節(jié)炎的效 果。
[0009] 發(fā)明人經(jīng)過大量實驗獲知NODl蛋白抑制多肽能夠抑制佐劑型大鼠類風濕關節(jié)炎 和DBA/1小鼠膠原型類風濕性關節(jié)炎的發(fā)展，體內實驗證明具有顯著的治療類風濕型關節(jié) 炎的效果。說明本發(fā)明設計的NODl蛋白抑制多肽科學、合理、可行有效，能作為治療或預防 類風濕性關節(jié)炎藥物。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1
[0011] NODl蛋白抑制多肽在膠原誘導小鼠關節(jié)炎動物模型體內免疫保護作用
[0012] 構建膠原型小鼠關節(jié)炎動物模型，研究NODl蛋白抑制多肽對小鼠膠原誘導性關 節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA)的治療作用。采用小鼠作為受試動物，SPF級 DBA/1小鼠60只（由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK(滬）2008-0016)，雄性，7-8周齡，體重為 18-22g，隨機分成6組，分別是正常對照組，模型對照組，多肽低中高3個劑量組（1，2,4mg/ kg)和陽性藥對照組（甲氨蝶呤2mg/kg)。除正常組外，第0天各實驗組建立小鼠 CIA模型， 方法是雞軟骨II型膠原（c II )用0. lmol/1醋酸溶解成4mg/ml的溶液，于4°C冰箱過夜。 實驗當天用 II 型膠原與含 4mg/ml Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv 的完全弗 氏佐劑（CFA)等體積充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮內每只注射乳化劑50 μ I 進行致敏，21d后用4mg/ml的II型膠原（c II )與不完全弗氏佐劑（IFA)等體積充分乳化后 以相同劑量的乳化劑于尾部進行再次免疫。造模第30d起皮下注射給藥：多肽的3個劑量 組（l，2,4mg/kg):每日兩次，連續(xù)7天；陽性藥對照組（甲氨蝶呤2mg/kg):每3天一次，連 續(xù)3次；正常對照組和模型對照組（生理鹽水）：連續(xù)7天。分別于造模后第38天測關節(jié) 評分、分別檢測左右后足足踝直徑來觀察藥物對小鼠膠原型關節(jié)炎的影響。
[0013] NODl蛋白抑制多肽在膠原誘導小鼠關節(jié)炎動物模型體內免疫保護作用具體結果 如下：NODl蛋白抑制多肽對小鼠膠原型關節(jié)腫脹度的影響，陽性對照組、NODl蛋白抑制多 肽高、中、低劑量組關節(jié)腫脹度與模型組比較，均有極顯著性差異（P〈〇. 01)實驗結果具有 統(tǒng)計學意義。NODl蛋白抑制多肽對小鼠膠原型關節(jié)炎足爪腫脹度的影響，陽性對照組、NODl 蛋白抑制多肽高、中、低劑量組足爪腫脹度與模型組比較，均有極顯著性差異（P〈〇. 01)，實 驗結果具有統(tǒng)計學意義。多肽對膠原型關節(jié)炎小鼠關節(jié)評分的影響，多肽低、中、高劑量組 四肢評分顯著低于模型對照組（P < 0. 01)，與模型對照組比較極顯著性差異，實驗結果具 有統(tǒng)計學意義。
[0014] 表1 NODl蛋白抑制多肽對膠原型關節(jié)炎的影響（means土SD)
[0015]
[0017] · *Ρ〈0· 05 ;#Ρ〈0· 01 (和模型組比較）
[0018] 結論：NODl蛋白抑制多肽對小鼠膠原型關節(jié)炎具有治療作用。
[0019] 實施例2
[0020] NODl蛋白抑制多肽對佐劑型大鼠關節(jié)炎動物模型體內免疫保護作用
[0021 ] 構建佐劑型大鼠關節(jié)炎動物模型，研究多肽對佐劑性關節(jié)炎（Ad juvant arthritis，AA)大鼠的治療作用。采用大鼠作為受試動物，SPF級SD大鼠60只（由上海 西普爾-必凱實驗動物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，動物生產(chǎn) 許可證號碼：SCXK (滬）2008-0016)，雄性，體重為140g-160g，隨機分成6組，分別是正常對 照組，模型對照組，NODl蛋白抑制多肽低中高3個劑量組（0. 5, l，2mg/kg)和陽性藥對照組 (甲氨蝶呤lmg/kg)。除正常組外，第0天各實驗組建立大鼠 AA模型，方法是在大鼠的左側 后足足跎注射含滅活的結核分枝桿菌（H37RA，10mg/ml)完全弗氏佐劑0.1 ml造成大鼠佐劑 性關節(jié)炎模型。造模第10天起皮下注射給藥：多肽的3個劑量組（0.5，l，2mg/kg):每日兩 次，連續(xù)7天；陽性藥對照組（甲氨蝶呤lmg/kg):每3天一次，連續(xù)3次；正常對照組和模 型對照組（生理鹽水）：連續(xù)7天。造模后第18天，關節(jié)評分、分別檢測左右后足足踝直徑 來觀察藥物對大鼠佐劑型關節(jié)炎的影響。
[0022] 多肽在佐劑性大鼠關節(jié)炎動物模型體內免疫保護作用，具體結果如下：NODl蛋白 抑制多肽對大鼠原發(fā)性關節(jié)炎足爪腫脹度的影響，大鼠陽性對照組、NODl蛋白抑制多肽的 低、中、高劑量組左后足踝直徑與模型組比較，有極顯著性差異（P〈〇. 01) ;N0D1蛋白抑制多 肽對大鼠繼發(fā)性關節(jié)炎右后足踝直徑的影響，大鼠陽性對照組、NODl蛋白抑制多肽低、中、 高劑量組右后足踝直徑與模型組比較，有顯著性差異（P〈〇. 05)。NODl蛋白抑制多肽對佐 劑型關節(jié)炎大鼠關節(jié)評分的影響，多肽低、中、高劑量組四肢評分顯著低于模型對照組（P < 0. 05)，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。
[0023] 表2 NODl蛋白抑制多肽對佐劑型關節(jié)炎的影響（means土SD)
[0025] · *Ρ〈0· 〇5 ;林P〈0. 01 (和模型組比較）
[0026] 結論：NODl蛋白抑制多肽對AA大鼠關節(jié)炎的魚具有治療作用。
【主權項】
1. NODl蛋白抑制多肽，其特征在于其序列為MKNMWKSARKIDAFQHM。2. 權利要求1的NODl蛋白抑制多肽在制備治療和預防類風濕關節(jié)炎疾病藥物中的應 用。3. 根據(jù)權利要求2所述NODl蛋白抑制多肽在制備治療和預防類風濕關節(jié)炎疾病藥物 中的應用，其特征在于：可通過多種給藥方式治療和預防類風濕關節(jié)炎疾病，包括皮下或肌 肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥丸、膠囊等，鼻噴劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及具有抑制NOD1蛋白，能預防或治療類風濕性關節(jié)炎的多肽。其序列為MKNMWKSARKIDAFQHM是全新的序列，其用途可通過多種給藥方式治療和預防類風濕關節(jié)炎疾病，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥丸、膠囊等，鼻噴劑等。本發(fā)明設計的NOD1蛋白抑制多肽科學、合理、可行有效，能作為治療或預防類風濕性關節(jié)炎藥物。
【IPC分類】C07K7/08, A61P29/00, A61K38/10, A61P19/02
【公開號】CN105017388
【申請?zhí)枴緾N201510547618
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月31日