豬vip改良肽及其在大腸桿菌中的表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬VIP改良肽及其在大腸桿菌中的表達(dá) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，抗生素的大量使用甚至濫用導(dǎo)致病原菌耐藥性菌株甚至 超級細(xì)菌產(chǎn)生、抗生素在畜禽產(chǎn)品中殘留以及隨動物糞尿排出污染環(huán)境等一系列嚴(yán)峻問 題，嚴(yán)重影響了畜產(chǎn)品品質(zhì)和人類健康。因此，研制安全、高效、不易產(chǎn)生耐藥性的環(huán)保型防 病保健類畜禽用藥物或添加劑來替代抗生素已迫在眉睫。動物體內(nèi)存在的一類天然防御類 生物活性肽一抗菌肽因其具抗菌譜廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、無毒副作用、無藥殘、不易產(chǎn)生耐藥菌株 等系列優(yōu)點(diǎn)，對其研究開發(fā)已成為探尋抗生素理想替代品的前沿性課題，被認(rèn)為是新型抗 生素研究的新資源和重要途徑。豬體內(nèi)存在的天然活性肽VIP具有開發(fā)為防病保健類飼料 添加劑或獸用藥品的優(yōu)勢和潛力：（1)結(jié)構(gòu)簡單明確：由28個(gè)氨基酸殘基組成的直鏈肽；
[2] 具有多種生物學(xué)活性，而且活性較強(qiáng)：免疫調(diào)節(jié)、抗炎，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等 具有較強(qiáng)的抑殺作用；（3)作用濃度?。河捎赩IP屬于內(nèi)源性的激素類神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié) 肽（腦腸肽），因此，以較小的作用濃度（miioL級）就能發(fā)揮較強(qiáng)的生物活性。VIP本身具 有的特性使它具有開發(fā)為高效、安全的防病保健類飼料添加劑和藥物的潛力和廣闊的應(yīng)用 前景。
[0003] 然而，由于內(nèi)源性的抗菌肽資源有限，直接分離純化困難，化學(xué)合成肽類成本高， 而基因工程方法大量表達(dá)抗菌肽使之成為新興飼料添加劑的途徑更為現(xiàn)實(shí)，并顯示出良好 前景。隨著對抗菌肽構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制的闡明，以天然抗菌肽為模板，設(shè)計(jì)其改良肽，并 對其進(jìn)行高效重組表達(dá)以開發(fā)抗生素替代品完全可行。利用基因工程方法獲得抗菌肽的嘗 試已在原核和真核體系獲得成功，但異源高效表達(dá)抗菌肽仍面臨多種困難，一是抗菌肽的 編碼基因轉(zhuǎn)錄后的HiRNA較小，一般只有100~200bp，同時(shí)其表達(dá)的抗菌肽在表達(dá)細(xì)胞中 也容易被降解，很難實(shí)現(xiàn)抗菌肽的大量表達(dá)；二是抗菌肽具有抗菌作用，表達(dá)宿主，如細(xì)菌 或酵母細(xì)胞表達(dá)的抗菌肽會反饋性抑制宿主細(xì)胞活性，影響抗菌肽的進(jìn)一步表達(dá)。由此可 見，如何進(jìn)一步提高表達(dá)水平，在高表達(dá)的同時(shí)充分保持抗菌肽的生物學(xué)活性，提高基因表 達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，設(shè)計(jì)并表達(dá)抗菌活性更強(qiáng)、抗菌譜更廣的抗菌肽等都是值得深入探究的 問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種豬VIP改良肽及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)方法，以解 決現(xiàn)有肽抗菌活力不足和抗菌譜不廣，以及現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)流程復(fù)雜、生產(chǎn)成本高的問題。
[0005] 本發(fā)明所采用的第一種技術(shù)方案是，一種豬VIP改良肽，所述的豬VIP改良肽為如 下氨基酸序列：FTANYTRLRRQLAVRRYLAAILGRR。
[0006] 本發(fā)明所采用的第二種技術(shù)方案是，一種豬的VIP改良肽在大腸桿菌中的表達(dá)方 法，按照以下步驟實(shí)施：
[0007] 步驟1、豬VIP改良肽的基因的克隆：
[0008] 根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，由豬VIP改良肽的氨基酸序列推導(dǎo)獲得豬VIP改良 肽的核苷酸序列為：
[0009] TTTACCGCAAATTATACCCGTCTGCGTCGTCAGCTGGCAGTTCGTCGTTATCTGGCAGCAATTCTGGGT CGTCGT ；
[0010] 為避免改良肽對大腸桿菌宿主菌的毒性，將TrxA與PVIPni進(jìn)行融合表達(dá)，設(shè)計(jì)目 的基因的核苷酸序列為113bp，具體序列為：
[0012] 其中，方框標(biāo)示的部分分別為XhoI和KpnI酶切位點(diǎn)；下劃線標(biāo)識的部分為腸激酶 識別序列；TAA為終止密碼子；黑體傾斜部分為PVIP ni基因序列；
[0013] 為了獲得所述目的基因，設(shè)計(jì)合成了三條引物PI、P2和P3，具體為：
[0017] 其中，所述引物序列Pl和引物序列P2中的方框分別表示XhoI和KpnI酶切位點(diǎn)， 引物擴(kuò)增長度為113bp，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對得到的目的基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和測序鑒 定，說明已成功克隆了豬VIP改良肽基因；
[0018] 步驟2、豬VIP改良肽重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定：
[0019] 對擴(kuò)增獲得的豬VIP改良肽基因和pET32a(+)分別同時(shí)進(jìn)行雙酶切，然后將豬 VIP改良肽基因與pET32a(+)進(jìn)行連接，以將其構(gòu)建到表達(dá)載體上，獲得的重組質(zhì)?？删幋a TrxA-PVIPni融合蛋白；同樣轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)后經(jīng)測序進(jìn)行鑒定，說 明豬VIP改良肽的表達(dá)載體構(gòu)建成功；
[0020] 步驟3、豬VIP改良肽對大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)：
[0021] 將所述的重組質(zhì)粒PETSS-PVIPni轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到 PET32-PVIP/BL21 (DE3)重組菌；將重組菌接種于氨芐含量為100 μ g/mL的LB培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)后得到菌液，對菌液進(jìn)行表達(dá)量檢測；
[0022] 步驟4、融合蛋白的純化：
[0023] 使用Ni-NTA親和層析純化超聲上清中的融合蛋白，依次用含有不同濃度咪唑的 PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用S印hadex G25對Ni-NTA純化所得融合蛋白進(jìn)行脫鹽， 使用超濾管對產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，即可得到純化后的融合蛋白TrxA-PVIP ni;
[0024] 步驟5、豬VIP改良肽的釋放：
[0025] 用人工引入的腸激酶切割位點(diǎn)切割融合蛋白TrxA-PVIPni，去除擔(dān)體蛋白，釋放目 標(biāo)抗菌肽；將步驟4中純化濃縮的融合蛋白PVIP ni用腸激酶進(jìn)行酶切，即成功釋放重組表達(dá) ρν?Ρη〇
[0026] 進(jìn)一步的，步驟I中的豬VIP改良肽基因的PCR反應(yīng)體系為：ddH20 20 yL， IOXBuffer 含 Mg2+5yL，dNTP 2.5mM 4yL，引物 Ρ15μΜ 10yL，引物 Ρ25μΜ 0.5yL，弓 I 物 P35 μ M 10 μ L，pfu 0· 5 μ L ;PCR 反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性 5min ;94°C 30s，60°C 40s， 72°C Imin進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min ;4°C保存。
[0027] 進(jìn)一步的，步驟2中豬VIP改良肽重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：用雙酶切 連接法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32-pVIPJ寸，按外源基因與質(zhì)粒摩爾數(shù)比為3 :1的比例進(jìn)行混合， 反應(yīng)體系為10uL，16°C過夜。
[0028] 進(jìn)一步的，步驟2中轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞的方法為：將10 μ L的連接產(chǎn)物加入到 感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min ;42°C水浴60s，快速移至冰水浴中放置2min，加入500uL LB， 37°C 180rpm培養(yǎng)Ih ;取部分菌液涂布于LB平板，所述LB平板含有濃度為100 μ g/mL的氨 芐；37°C倒置培養(yǎng)12~16h，觀察單菌落，如果有陽性克隆菌并經(jīng)測序進(jìn)行鑒定，說明豬VIP 改良肽的表達(dá)載體構(gòu)建成功。
[0029] 進(jìn)一步的，連接產(chǎn)物的制備方法為：將連接緩沖液1 μ L，無菌水2 μ L，T4連接酶 1 μ L，雙酶切后割膠回收的ρΕΤ32質(zhì)粒2 μ L，雙酶切后割膠回收的PCR產(chǎn)物4 μ L混合后， 16°C反應(yīng)16h，得到連接產(chǎn)物。
[0030] 進(jìn)一步的，步驟3中誘導(dǎo)表達(dá)的具體方法為，將重組菌接種于氨芐含量為100 μ g/ mL的LB培養(yǎng)基中，于37°C 180rpm培養(yǎng)16~24h，按1 %的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的氨芐含量 為100 μ g/mL的LB培養(yǎng)基中，37°C 180rpm振蕩培養(yǎng)至OD6。。約0. 6時(shí)，加入終濃度0. 4mM的 IPTG，誘導(dǎo)4h，得到菌液。
[0031] 進(jìn)一步的，步驟3中對菌液表達(dá)量檢測的具體方法為：將誘導(dǎo)表達(dá)菌液14000~ 15000rpm 4°C離心10min，棄上清，向菌體中加入5mL pH 8. 0的磷酸鈉緩沖液，重懸，冰浴 中超聲破碎；4°C，14000~15000r pm離心15min，收集超聲上清液；取一定量加入相應(yīng)上樣 緩沖液煮沸，使用15 % SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，并用Bradford法測定超聲上清中總蛋 白含量，使用Quantity One掃描SDS-PAGE凝膠，計(jì)算目的蛋白占總蛋白的含量。
[0032] 進(jìn)一步的，步驟4中PBS緩沖液的組成為20mM PBS，0. 5M N