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一種抗cd3/抗cd19雙特異性抗體及其應(yīng)用

文檔序號:9299647閱讀:3923來源:國知局
一種抗cd3/抗cd19雙特異性抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗體藥物開發(fā)和生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。具體地,本發(fā)明涉及抗⑶3/抗⑶19 雙特異性抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] B淋巴細胞白血病和惡性淋巴瘤是原發(fā)于骨髓造血系統(tǒng)和淋巴結(jié)并彌漫全身的惡 性腫瘤。傳統(tǒng)的放化療雖然有一定療效,但沒有選擇性,對正常組織的損傷很大。近年來,生 物治療方法廣泛應(yīng)用于腫瘤治療,尤其是單克隆抗體,如rituximab (muuamh,并因其特 異靶向性、高親和性而收到了良好效果。單抗通過Fc段與效應(yīng)細胞表面活性受體Fe YR I / Fc γ RIII結(jié)合,從而介導(dǎo)殺傷作用,但具有免疫殺傷作用的T細胞因為表面缺乏上述受體而 不能被有效介導(dǎo),從而削弱了機體對腫瘤的免疫效應(yīng)。
[0003] 雙特異性抗體(bispecific T cell engagers, BiTEs)是一種以T細胞作為效應(yīng) 細胞的雙特異性單鏈抗體,它具有兩個抗原結(jié)合臂,可以同時和T細胞及靶細胞結(jié)合,并激 活細胞毒性T細胞殺傷病變細胞。和其它雙特異性抗體相比,BiTEs的分子柔韌性更好,能 更好地促進CD3復(fù)合體和腫瘤靶標(biāo)的連接,并且它不受T細胞受體和靶細胞上MHC I類分 子的約束,不需要共刺激分子的參與,是一種極具應(yīng)用潛力的抗體形式。
[0004] BiTEs采用單鏈抗體技術(shù),將兩個不同抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)連接在一條多肽 鏈上,其基本的形式是V-linker-Vm-linker-Vf^-linker-Vu。BiTEs具有兩個抗原結(jié)合部 位,可以同時和T細胞及病變細胞表面的抗原分子結(jié)合,從而有效地激活靜止的T細胞來達 到殺傷病變細胞的目的。由于其獨特的結(jié)構(gòu)形式和特性,BiTEs可以用于克服其它雙特異 性抗體在腫瘤治療上的缺陷。雙特異性抗體是通過鼠源性單克隆抗體的化學(xué)偶聯(lián)、雙雜交 瘤和基因工程3個發(fā)展階段所制備的一種非天然抗體或抗體雜合分子,隨著生物技術(shù)的日 益進步,國內(nèi)外雙特異性抗體的相關(guān)研究日趨深入,其在臨床治療中作為一種新的二次導(dǎo) 向系統(tǒng)具有潛在的應(yīng)用價值。
[0005] 非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin, s lympho-ma,NHL)是一組起源于淋巴組織并彌漫 全身的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率已居惡性腫瘤第5位。大部分NHL來源于B淋巴細胞 (B-NHL)。⑶3是T淋巴細胞表面特異分子,通過它可以募集具有殺傷作用的T淋巴細胞,而 CD19是B淋巴細胞表面特異標(biāo)志,分子量為95X IO3的穿膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族 成員,與B細胞活化和信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),在前B淋巴細胞、未成熟B淋巴細胞、成熟B淋巴細 胞、激活的B淋巴細胞中表達,在漿細胞、淋巴多能干細胞以及其他組織中均無表達。大多 數(shù)NHL起源于B淋巴細胞,95 %以上的B細胞NHL表達⑶19抗原,且⑶19抗原比較暴露, 人體血清中也無游離的CD19存在,因此CD19可作為治療B細胞淋巴瘤的靶點。單抗應(yīng)用 于腫瘤治療由于其分子量大、半衰期長,很難穿透腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作用。而微型雙特異 性抗體具有分子量小、半衰期短且具有較好的腫瘤細胞穿透性,本身細胞毒作用低。T細胞 表面抗原CD3和腫瘤細胞表面相關(guān)表達抗原的雙特異性微型抗體介導(dǎo)的抗腫瘤治療,以及 體外致敏的樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)誘導(dǎo)的相對特異的細胞毒性T淋巴細胞 (cytotoxic T lymphocyte,CTL)對腫瘤的殺傷等,被認(rèn)為是傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放化療方法 之外最有希望清除殘余腫瘤細胞和微小轉(zhuǎn)移病灶從而根治腫瘤的輔助治療措施,許多動物 實驗和臨床試驗已經(jīng)證實了該生物治療措施的療效。
[0006] 本發(fā)明的抗⑶3/抗⑶19雙特異性抗體是在抗⑶3scFv和抗⑶19scFv載體基礎(chǔ) 上構(gòu)建而成。CD19是較為理想的腫瘤相關(guān)抗原,它表達于除干細胞以外的B淋巴細胞發(fā)育 的各個階段,因此B細胞來源的惡性細胞均有⑶19表達,⑶3是T淋巴細胞表面特異分子。 因此本發(fā)明提供了一種新型抗CD3/抗CD19雙特異性抗體的構(gòu)建,以期能夠獲得比已有抗 CD3/抗CD19雙特異性抗體家族的其他抗體更好的通過橋接作用介導(dǎo)T細胞高效特異殺傷 B淋巴細胞來源的腫瘤細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明構(gòu)建了大容量的天然人源噬菌體抗體庫,從中篩選獲得了全人源抗CD3單 鏈抗體和抗CD19單鏈抗體。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種抗⑶3/抗⑶19雙特異性抗體,它包含全人源抗⑶3單 鏈抗體和全人源抗CD19單鏈抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中相應(yīng)的重鏈可變區(qū)(V h)和相應(yīng)的輕 鏈可變區(qū)(\)從N-未端到C-未端按照如下順序排列:
[0009] Vh (CD 19)-Vl (CD 19)-Vh (CD3)-Vl (CD3)或
[0010] VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)。
[0011] 本發(fā)明公開的全人源抗⑶3單鏈抗體,重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO :7所 示,輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO :8所示。
[0012] 本發(fā)明公開的全人源抗⑶19單鏈抗體,重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 15 所示,輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 16所示。
[0013] 本發(fā)明的抗⑶3/抗⑶19雙特異性抗體通過構(gòu)建真核或原核表達載體,轉(zhuǎn)化入相 應(yīng)的真核或原核細胞內(nèi)進行重組表達。
[0014] 本發(fā)明還公開了上述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞,為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌, 中華倉鼠卵巢細胞(CHO)、小倉鼠腎細胞(BHK)、C0S細胞、小鼠 NSO胸腺瘤細胞等哺乳動物 細胞。
[0015] 本發(fā)明抗⑶3/抗⑶19雙特異性抗體的制備方法:將上述構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化至 上述的宿主細胞中,在適合所述全人源單克隆抗體表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)有上述表達載體的 宿主細胞,對培養(yǎng)物進行分離純化獲得上述的雙特異性抗體。
[0016] 本發(fā)明通過試驗證明:該抗體可以應(yīng)用于治療腫瘤的治療藥物的制備中。上述的 腫瘤可以為:非霍奇金淋巴瘤、B細胞白血病或霍奇金淋巴瘤等。同時通過現(xiàn)有的研究推 測:該抗體還有望應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療藥物的制備中。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的抗⑶3/抗⑶19雙特異性抗體對人⑶3和⑶19分 子具有高親和力,具有介導(dǎo)激活T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的作用。且抗體分子的重鏈和輕 鏈?zhǔn)侨嗽吹?,盡管嵌合的或人源化的也可以使用,但是用于人體時,全人源的可以避免很 多副作用,例如HAM和HACA反應(yīng)引起的那些副作用。
【附圖說明】
[0018] 圖I :針對⑶3和⑶19的單鏈雙特異性抗體的表達和純化的蛋白質(zhì)級分的代表性 SDS-PAGE分析。其中,泳道1為Marker ;泳道2為CHO細胞表達上清;泳道3為二步純化樣 品1 ;泳道4為二步純化樣品2。
[0019] 圖2A、B、C、E、F、G :FACS分析抗CD3/抗CD19的單鏈雙特異性抗體與Nalm6細胞 和Jurkat細胞結(jié)合活性。應(yīng)用流式細胞儀進行間接免疫熒光測定。其中,圖2A為Nalm6 細胞在PBS中孵育的陰性對照,圖2B為Nalm6細胞與抗CD3/抗CD19的單鏈雙特異性抗體 的結(jié)合結(jié)果,圖2C為Nalm6細胞與HIT19a單抗的結(jié)合結(jié)果(陽性對照),圖2E為Jurkat 細胞在PBS中孵育的陰性對照,圖2F為Jurkat細胞與抗CD3/抗CD19的單鏈雙特異性抗 體的結(jié)合結(jié)果,圖2G為Jurkat細胞與HIT3a單抗的結(jié)合結(jié)果(陽性對照)。結(jié)果表明抗 CD3/抗CD19雙特異性抗體能與Nalm6和Jurkat細胞特異性結(jié)合,說明該雙功能抗體具有 與⑶3和⑶19靶抗原結(jié)合能力。
[0020] 圖3D、H :FACS分析抗CD3/抗CD19的單鏈雙特
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