自催化atrp制備血紅蛋白印跡聚合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種血紅蛋白印跡聚合物的制備方法,尤其是一種無(wú)需過(guò)渡金屬催化劑的自催化ATRP制備血紅蛋白印跡聚合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血紅蛋白是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載氧的一種重要蛋白質(zhì),它參與血液中CO2的運(yùn)輸以及血液pH值的調(diào)節(jié),臨床上,血紅蛋白的檢測(cè)可為心血管疾病、肺部疾病、某些腫瘤疾病等提供診斷依據(jù),因此,靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)血清中血紅蛋白含量具有重要意義。
[0003]目前血紅蛋白的常用檢測(cè)方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法以及分子印跡技術(shù)等,放射免疫分析法及酶聯(lián)免疫分析法需要制備抗體,利用血紅蛋白與其抗體發(fā)生的特異反應(yīng)(即免疫反應(yīng))進(jìn)行檢測(cè)??贵w制備周期長(zhǎng),尤其是單克隆抗體價(jià)格十分昂貴,同時(shí),放射免疫分析需要特殊實(shí)驗(yàn)室,對(duì)操作人員身體損傷嚴(yán)重,而酶聯(lián)免疫分析耗時(shí)較多。分子印跡技術(shù)是一種新型高效分離技術(shù),其分離作用來(lái)源于分子印跡聚合物(molecularlyimprinted polymers,MIP)所具有的類似天然抗體或酶的分子識(shí)別功能。與前兩種分析方法相比,具有適應(yīng)性強(qiáng)、化學(xué)穩(wěn)定性高、對(duì)壓力、溫度極具耐受性等優(yōu)點(diǎn),同時(shí),MIP的制備簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,因此近年來(lái)發(fā)展迅速,在色譜分離、固相萃取、催化合成、免疫測(cè)定等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。
[0004]分子印跡技術(shù)的核心是MIP的制備,現(xiàn)有的制備方法是通過(guò)模板分子與功能單體相互作用(如氫鍵、范德華力、靜電作用等)形成復(fù)合物,在引發(fā)劑的作用下使功能單體、交聯(lián)劑聚合形成具有適當(dāng)剛性的聚合物,最后在一定條件下除去模板分子,聚合物中就形成了與模板分子大小、空間結(jié)構(gòu)、電荷分布等多重互補(bǔ)的空穴,從而對(duì)模板分子具有識(shí)別選擇性?!盎钚浴?可控自由基聚合是目前高分子科學(xué)中非?;钴S的研究領(lǐng)域,原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)是實(shí)現(xiàn)“活性”/可控聚合的有效手段,它以有機(jī)鹵化物為引發(fā)劑,低價(jià)態(tài)過(guò)渡金屬配合物(除常見(jiàn)的Cu外,還包括Fe、Co、Ti等的配合物)為鹵原子載體(過(guò)渡金屬催化劑),通過(guò)氧化還原反應(yīng),在活性種與休眠種之間建立動(dòng)態(tài)平衡,可以對(duì)聚合物的端基、組成、結(jié)構(gòu)、分子量等進(jìn)行有效控制;同時(shí),ATRP能夠?qū)崿F(xiàn)水相、室溫、一定pH下的表面引發(fā)、原位聚合等。可見(jiàn),催化劑是ATRP體系的重要組成部分,它決定著休眠種與活性種之間可逆轉(zhuǎn)化反應(yīng)的平衡。目前已有將三電極體系引入ATRP的相關(guān)報(bào)道,所公開的操作方法如下:將引發(fā)劑修飾電極作為工作電極,工作電極與參比電極、對(duì)電極構(gòu)成三電極體系;將此三電極體系放入由功能單體、交聯(lián)劑、模板分子以及低價(jià)態(tài)過(guò)渡金屬配合物配制成的溶液中,在工作電極與參比電極之間恒定電勢(shì)一定時(shí)間,得到聚合物;再用洗脫液洗脫模板分子并脫除催化劑,得到印跡聚合物。
[0005]然而,如采用現(xiàn)有ATRP方法制備蛋白質(zhì)MIP,則存在如下問(wèn)題:
1.所需的低價(jià)態(tài)金屬配合物對(duì)空氣等敏感而不易保存;
2.所需的低價(jià)態(tài)金屬配合物對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子具有一定的毒性;
3.脫除催化劑的后處理工藝比較復(fù)雜,加大制備成本。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題,提供一種不需過(guò)渡金屬催化劑的自催化ATRP制備血紅蛋白印跡聚合物的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種自催化ATRP制備血紅蛋白印跡聚合物的方法,其特征在于按照如下步驟進(jìn)行:
a.將含溴化合物修飾電極作為工作電極,所述工作電極與參比電極、對(duì)電極構(gòu)成三電極體系;
b.將所述三電極體系放入由功能單體、交聯(lián)劑和血紅蛋白分子配制成的溶液中,在工作電極與參比電極之間施加-0.3?-0.8V恒定電勢(shì)60?240min,得到血紅蛋白聚合物;
c.用洗脫液洗脫血紅蛋白分子,得到血紅蛋白質(zhì)印跡聚合物。
[0008]本發(fā)明利用血紅蛋白的含鐵性質(zhì),通過(guò)電勢(shì)控制血紅蛋白中鐵的價(jià)態(tài),使其作為模板分子的同時(shí)作為催化劑,無(wú)需另外添加過(guò)渡金屬催化劑,解決了現(xiàn)有ATRP技術(shù)應(yīng)用于血紅蛋白印跡聚合物制備時(shí)所存在的低價(jià)態(tài)金屬催化劑對(duì)空氣等敏感而不易保存,催化劑對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子具有一定的毒性以及脫除催化劑后處理工藝比較復(fù)雜等問(wèn)題。本發(fā)明所制備的印跡聚合物具有較好的識(shí)別性,并可利用電化學(xué)方法對(duì)血紅蛋白實(shí)現(xiàn)較好的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的原理及過(guò)程示意圖。
[0010]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的不同電極在含有0.lmmol/L的[Fe (CN)6]3 /4的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安圖。
[0011]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的不同電極在含有0.lmmol/L的[Fe(CN)6]3 /4的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中的電化學(xué)交流阻抗圖。
[0012]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1血紅蛋白印跡聚合物修飾電極表面。
[0013]圖5是本發(fā)明實(shí)施例1的印跡聚合物修飾電極對(duì)1.0X 10 mg/mL血紅蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、組氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸的選擇性示意圖。
[0014]圖6為本發(fā)明實(shí)施例1的印跡聚合物修飾電極的示差脈沖伏安法(DPV)響應(yīng)電流變化值與血紅蛋白濃度的關(guān)系示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1:
首先按照現(xiàn)有技術(shù),利用引發(fā)劑-含溴化合物修飾電極表面,然后按照以下步驟進(jìn)行:
a.將含溴化合物修飾金電極作為工作電極,飽和甘汞電極做參比電極、鉑電極做對(duì)電極,所述工作電極與參比電極、對(duì)電極構(gòu)成三電極體系;
b.將所述三電極體系放入由0.28g丙烯酰胺、0.093g N,N-亞甲基異丙烯酰胺和
0.019g血紅蛋白分子配制成的溶液中,在工作電極與參比電極之間施加恒定電勢(shì)-0.6V,施加 240min ;
c.將所述工作電極放入10%(v/v)醋酸與10%(v/v)十二烷基硫酸鈉溶液組成的洗脫劑中,浸泡120min,洗脫血紅蛋白分子得到血紅蛋白印跡聚合物。
[0016]工作原理:
從分子結(jié)構(gòu)來(lái)看,每一血紅蛋白分子由四分子的珠蛋白和四分子亞鐵血紅素組成,每個(gè)血紅素又由4個(gè)吡咯環(huán)構(gòu)成,在吡咯環(huán)中央有一個(gè)鐵原子,通常,這個(gè)鐵原子是三價(jià)態(tài)的。本發(fā)明利用三電極體系(工作電極、參比電極、對(duì)電極),通過(guò)調(diào)節(jié)工作電極(溴化物修飾電極)的電勢(shì)還原血紅蛋白中的三價(jià)鐵為二價(jià)鐵,使血紅蛋白作為模板蛋白質(zhì)的同時(shí),成為鐵基催化劑,進(jìn)而引發(fā)功能單體、交聯(lián)劑聚合,制備血紅蛋白分子印跡聚合物。
[0017]具體工作過(guò)程及原理如圖1所示。
[0018]圖2為實(shí)施例1的不同電極在含有0.lmmol/L的[Fe (CN)6]3 /4的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安圖,掃速為100mV/S,右圖是左圖中間曲線的放大圖。圖2中曲線a為裸金電極,b為溴化物修飾金電極,c為血紅蛋白催化聚合后的聚合物修飾金電極,d為洗脫了血紅蛋白質(zhì)的印跡聚合物修飾電極。
[0019]從圖2中可以看出裸金電極的CV曲線出現(xiàn)了一對(duì)較為對(duì)稱的氧化還原峰(曲線a),說(shuō)明[Fe(CN)6]3/4在電極上的反應(yīng)是準(zhǔn)可逆的;裸金電極表面被溴化物修飾后,其氧化還原電流有了明顯的降低(曲線b),說(shuō)明溴化物已成功組裝到電極表面上;實(shí)施聚合