長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種菌種及其制備方法和應(yīng)用，具體說是一種長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株及 其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)鏈二元酸是重要化工原料，具有極其廣泛的用途，能夠合成香料、特種尼龍、高 級(jí)潤(rùn)滑油等一系列高附加值的化學(xué)品。長(zhǎng)鏈二元酸可應(yīng)用在軍用領(lǐng)域、航空航天器的涂層、 管路、汽車的表面涂層及油管等；在民用領(lǐng)域，可應(yīng)用于汽車、日化香料、工程塑料、尼龍行 業(yè)等十多個(gè)高新科技行業(yè)，可開發(fā)出更多的下游產(chǎn)業(yè)，形成新興的產(chǎn)業(yè)鏈。
[0003] 以往，長(zhǎng)鏈二元酸采用化學(xué)合成法生產(chǎn)，其專利技術(shù)被國(guó)外所擁有?；瘜W(xué)合成法生 產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸，不僅產(chǎn)品種類單一，且合成工藝復(fù)雜、成本高、污染大。我國(guó)是世界上唯一能 夠采用微生物發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)多種長(zhǎng)鏈二元酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的國(guó)家。此前，我國(guó)二元酸 生產(chǎn)菌種的改良均是通過不同方式誘變等傳統(tǒng)育方法實(shí)現(xiàn)的。傳統(tǒng)育種方法具有很大隨機(jī) 性，篩選復(fù)雜。通過傳統(tǒng)育種的方法已經(jīng)很難進(jìn)一步提高菌株的性能。當(dāng)前長(zhǎng)鏈二元酸工 業(yè)化生產(chǎn)過程中仍有許多瓶頸問題，如底物轉(zhuǎn)化率有待提高、生產(chǎn)能耗非常巨大等等。
[0004] 代謝工程技術(shù)可以在基因水平上有針對(duì)性的進(jìn)行菌種分子改造，獲得性能更加優(yōu) 良的新菌株。如圖1、圖2所示，二元酸代謝途徑主要包括ω-氧化途徑和β-氧化途徑， 其中前者為二元酸合成途徑，后者涉及二元酸降解途徑。代謝工程的目的是通過分子改造 手段來提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。國(guó)際上，Henkel公司（后來的Cognis公 司）有專利報(bào)道（US005254466A)，用基因敲除方式來優(yōu)化二元酸生產(chǎn)菌株，依次將4個(gè)POX 基因敲除，達(dá)到完全阻斷β-氧化，使底物轉(zhuǎn)化率提高為100%。在此基礎(chǔ)上，該公司進(jìn)一 步通過代謝工程手段共表達(dá)CYP單加氧酶和還原酶，以達(dá)到增強(qiáng)ω -氧化的目的，產(chǎn)量提高 30% (World Patent W0/91/06660)。
[0005] 但是利用該菌株進(jìn)行批式發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其工藝仍無法與當(dāng)時(shí)其他二元酸生產(chǎn)工藝競(jìng) 爭(zhēng)，而最終沒有進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。Henkel公司對(duì)菌種進(jìn)行分子改造所使用的篩選標(biāo)記為尿 嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型。Henkel公司發(fā)明專利的缺點(diǎn)為：1、出發(fā)菌株不是工業(yè)化生產(chǎn)所用的高產(chǎn) 菌株；2、發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸所用的假絲酵母為二倍體，即每個(gè)細(xì)胞具有兩套染色體，每 個(gè)基因都有對(duì)應(yīng)的等位基因，而且催化每步體內(nèi)生化反應(yīng)的酶往往由多個(gè)基因編碼。因此， 通過代謝工程手段來增強(qiáng)或減弱某個(gè)體內(nèi)生化反應(yīng)的活性，需要對(duì)編碼該酶的關(guān)鍵基因進(jìn) 行分子改造才有顯著效果。否則，改造后效果也不會(huì)顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有菌株生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸效果不顯著的技術(shù)問題，提供一種 生產(chǎn)效率高的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 為此，本發(fā)明提供一種長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其分類命名為假絲酵母菌Candida sp.TDTC025,所述菌株于2014年3月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所；其保藏編號(hào)為=CGMCC No. 8930。
[0008] 本發(fā)明中的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株所述假絲酵母菌的pex5基因被敲除一個(gè)拷貝， 所述pex5基因的堿基序列如序列表中的序列5所示。為該菌株基因組中編碼該酶的多個(gè) 基因中對(duì)于長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)最為關(guān)鍵的一個(gè)。
[0009] 本發(fā)明同時(shí)提供一種長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其包括如下步驟：（1)準(zhǔn) 備引物PEX5-F和PEX5-R ; (2)準(zhǔn)備長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株感受態(tài)細(xì)胞；（3)使用步驟（1)中的 引物進(jìn)行擴(kuò)增clonNAT抗性基因，利用擴(kuò)增的產(chǎn)物對(duì)菌種中的基因 pex5被敲除一個(gè)拷貝， 所述pex5基因的堿基序列如序列表中的序列5所示；(4)通過PCR擴(kuò)增、純化、電轉(zhuǎn)、篩選、 鑒定，得到長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明中長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，篩選步驟中使用的篩選標(biāo)記 為 cIonNAT〇
[0011] 優(yōu)選地，長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，步驟（2)中的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株假 絲酵母（Candida sp. ) DC12〇
[0012] 本發(fā)明同時(shí)提供長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選地，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至70~80°C;再將pH調(diào)至9~9. 5,除去菌體 沉淀，保留上清；脫色，溫度保持在70~90°C，得到濾清液，用酸酸化至pH2. 5, 70~90°C保 溫，冷卻，離心或壓濾，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到長(zhǎng)鏈二元酸。
[0014] 本發(fā)明中的長(zhǎng)鏈二元酸是指含有十個(gè)以上碳原子的直鏈二羧酸，是一種重要的 精細(xì)化工中間原料，特別是十二碳二元酸（DC12)、十四碳二元酸（DC14)、十六碳二元酸 (DC16)和十八碳二元酸（DC18)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是，為了突破生產(chǎn)菌種遺傳改造的瓶頸，本發(fā)明通過解析生產(chǎn) 菌株的基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，分析ω-氧化和β-氧化代謝途徑，在基因組全局水平 上確立了二元酸代謝相關(guān)的一些關(guān)鍵靶位點(diǎn)，再通過代謝工程手段對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行分子改 造，并經(jīng)過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，獲得了性能更加優(yōu)良的菌株。本發(fā)明的TDTC025菌株（保藏號(hào)： CGMCCNo. 8927)，相比DC12菌株，轉(zhuǎn)化率得到明顯提高，為規(guī)模化生產(chǎn)帶來有益效果。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明涉及到的長(zhǎng)鏈二元酸合成相關(guān)ω-氧化代謝途徑；
[0017] 圖2為本發(fā)明涉及到的長(zhǎng)鏈二元酸降解相關(guān)β -氧化代謝途徑；
[0018] 圖3為本發(fā)明涉及到的基因敲除流程圖；
[0019] 圖4為HPLC分析DC12發(fā)酵生產(chǎn)的長(zhǎng)鏈二元酸；
[0020] 圖5為HPLC分析TDTC025發(fā)酵生產(chǎn)的長(zhǎng)鏈二元酸。
[0021] 本發(fā)明的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其分類命名為假絲酵母菌（Candida sp.) TDTC025 ;其保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地 址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期為2014年3 月18日，保藏號(hào)編號(hào)為：CGMCC No. 8930。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 序列表中序列的名稱如下：序列I :PEX5-F ;序列2 :PEX5-R ;序列3 :PEX5-U ;序列 4 :PEX5-D ;序列 5 :CandidaA01322〇
[0023] 以下實(shí)施例中觀察到的菌落及菌體形態(tài)歸納如下：
[0024] 固體培養(yǎng)基平板上，菌落奶酪狀，表面光滑，乳白色，飽滿凸起，菌落直徑約為2mm。 酵母樣單細(xì)胞，大小約為10x6 μm。大多情況下，以酵母樣單細(xì)胞形式，同時(shí)會(huì)有假菌絲體 形成，如在某些生長(zhǎng)階段或某種外界條件刺激下，假菌絲比例會(huì)顯著增加。
[0025] 以下實(shí)施例中使用了下面所列的培養(yǎng)基：
[0026] 1、YPD培養(yǎng)基，其配方為：1%的酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固體培養(yǎng)基， 加入2%瓊脂粉。上述百分比為質(zhì)量體積百分比，即每100毫升培養(yǎng)基所需該組分的克數(shù)。 若要添加抗生素，液體培養(yǎng)基在使用時(shí)加入至相應(yīng)終濃度。固體培養(yǎng)基在高壓滅菌后冷卻 至50攝氏度左右時(shí)，加入抗生素至相應(yīng)終濃度，混勻后立刻倒如無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固 后倒置，放于4攝氏度冰箱，兩周內(nèi)使用。
[0027] 2、種子培養(yǎng)基的配方：酵母膏1~8g/L，玉米楽；1~8g/L，鹿糖5~25g/L， KH2P044~12g/L，尿素0· 5~4g/L，重蠟40~70g/L，121°C滅菌30分鐘。其中，蔗糖和尿 素分開單獨(dú)ll〇°C滅菌20分鐘，滅菌后再合并混勻。
[0028] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方：酵母膏1~8g/L，玉米漿1~8g/L，蔗糖5~30g/L， KH2P044 ~15g/L，尿素 0· 5 ~4g/L，KN035 ~15g/