長鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種菌種及其制備方法和應用，具體說是一種長鏈二元酸生產(chǎn)菌株及 其制備方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長鏈二元酸是重要化工原料，具有極其廣泛的用途，能夠合成香料、特種尼龍、高 級潤滑油等一系列高附加值的化學品。長鏈二元酸可應用在軍用領(lǐng)域、航空航天器的涂層、 管路、汽車的表面涂層及油管等；在民用領(lǐng)域，可應用于汽車、日化香料、工程塑料、尼龍行 業(yè)等十多個高新科技行業(yè)，可開發(fā)出更多的下游產(chǎn)業(yè)，形成新興的產(chǎn)業(yè)鏈。
[0003] 以往，長鏈二元酸采用化學合成法生產(chǎn)，其專利技術(shù)被國外所擁有?；瘜W合成法生 產(chǎn)長鏈二元酸，不僅產(chǎn)品種類單一，且合成工藝復雜、成本高、污染大。我國是世界上唯一能 夠采用微生物發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)多種長鏈二元酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的國家。此前，我國二元酸 生產(chǎn)菌種的改良均是通過不同方式誘變等傳統(tǒng)育方法實現(xiàn)的。傳統(tǒng)育種方法具有很大隨機 性，篩選復雜。通過傳統(tǒng)育種的方法已經(jīng)很難進一步提高菌株的性能。當前長鏈二元酸工 業(yè)化生產(chǎn)過程中仍有許多瓶頸問題，如底物轉(zhuǎn)化率有待提高、生產(chǎn)能耗非常巨大等等。
[0004] 代謝工程技術(shù)可以在基因水平上有針對性的進行菌種分子改造，獲得性能更加優(yōu) 良的新菌株。如圖1、圖2所示，二元酸代謝途徑主要包括ω-氧化途徑和β-氧化途徑， 其中前者為二元酸合成途徑，后者涉及二元酸降解途徑。代謝工程的目的是通過分子改造 手段來提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。國際上，Henkel公司（后來的Cognis公 司）有專利報道（US005254466A)，用基因敲除方式來優(yōu)化二元酸生產(chǎn)菌株，依次將4個POX 基因敲除，達到完全阻斷β-氧化，使底物轉(zhuǎn)化率提高為100%。在此基礎(chǔ)上，該公司進一 步通過代謝工程手段共表達CYP單加氧酶和還原酶，以達到增強ω -氧化的目的，產(chǎn)量提高 30% (World Patent W0/91/06660)。
[0005] 但是利用該菌株進行批式發(fā)酵實驗，其工藝仍無法與當時其他二元酸生產(chǎn)工藝競 爭，而最終沒有進行規(guī)模化生產(chǎn)。Henkel公司對菌種進行分子改造所使用的篩選標記為尿 嘧啶營養(yǎng)缺陷型。Henkel公司發(fā)明專利的缺點為：1、出發(fā)菌株不是工業(yè)化生產(chǎn)所用的高產(chǎn) 菌株；2、發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸所用的假絲酵母為二倍體，即每個細胞具有兩套染色體，每 個基因都有對應的等位基因，而且催化每步體內(nèi)生化反應的酶往往由多個基因編碼。因此， 通過代謝工程手段來增強或減弱某個體內(nèi)生化反應的活性，需要對編碼該酶的關(guān)鍵基因進 行分子改造才有顯著效果。否則，改造后效果也不會顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有菌株生產(chǎn)長鏈二元酸效果不顯著的技術(shù)問題，提供一種 生產(chǎn)效率高的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應用。
[0007] 為此，本發(fā)明提供一種長鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其分類命名為假絲酵母菌（Candida sp.)TDTC027,所述菌株于2014年3月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所；其保藏編號為=CGMCC No. 8931。
[0008] 本發(fā)明中，長鏈二元酸生產(chǎn)菌株過氧化氫酶等位基因 CandidaA05093和 CandidaA09561之一的啟動子被強啟動子替換，所述的過氧化氫酶等位基因的堿基序列如 序列表中的序列8和序列9所示，過氧化氫酶基因為該菌株基因組中編碼該酶的多個基因 中對于長鏈二元酸生產(chǎn)最為關(guān)鍵的一個。
[0009] 本發(fā)明同時提供一種長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其包括如下步驟：（1)準 備引物Prol、Pr〇2、Pr〇3和Pro-4 ; (2)準備長鏈二元酸生產(chǎn)菌感受態(tài)細胞；（3)使用步驟 (1)中的引物進行擴增分別得到篩選標記Satl基因片段（引物Prol和Pr〇2)和強啟動子 片段（引物Pro3和Pro4)，再經(jīng)過一輪重疊 PCR將兩個片段連接起來，再將此重疊 PCR擴增 的產(chǎn)物通過同源重組替換過氧化氫酶等位基因的原始啟動子，達到增強過氧化氫酶基因表 達的目的，所述的過氧化氫酶等位基因的堿基序列如序列表中的序列8和序列9所示；(4) 通過PCR擴增、純化、電轉(zhuǎn)、篩選、鑒定，得到本發(fā)明的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明中長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，篩選步驟中使用的篩選標記 為cIonNAT抗性。
[0011] 優(yōu)選地，長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，步驟（2)中的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株假 絲酵母（Candida sp. ) DC12〇
[0012] 本發(fā)明同時提供長鏈二元酸生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)長鏈二元酸中的應用。
[0013] 優(yōu)選地，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至70~80°C ;再將pH調(diào)至9~
[0014] 9. 5,除去菌體沉淀，保留上清；脫色，溫度保持在70~90°C，得到濾清液，用酸酸 化至pH2. 5, 70~90°C保溫，冷卻，離心或壓濾，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到 長鏈二元酸。
[0015] 本發(fā)明中的長鏈二元酸是指含有十個以上碳原子的直鏈二羧酸，是一種重要的 精細化工中間原料，特別是十二碳二元酸（DC12)、十四碳二元酸（DC14)、十六碳二元酸 (DC16)和十八碳二元酸（DC18)。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是，為了突破生產(chǎn)菌種遺傳改造的瓶頸，本發(fā)明通過解析生產(chǎn) 菌株的基因組學和轉(zhuǎn)錄組學特征，分析ω-氧化和β-氧化代謝途徑，在基因組全局水平 上確立了二元酸代謝相關(guān)的一些關(guān)鍵靶位點，再通過代謝工程手段對這些位點進行分子改 造，并經(jīng)過發(fā)酵實驗驗證，獲得了性能更加優(yōu)良的菌株。本發(fā)明的TDTC027菌株（保藏號： CGMCC No. 8931)，相比DC12菌株，發(fā)酵月桂酸甲酯產(chǎn)酸量顯著提高，為規(guī)模化生產(chǎn)帶來有益 效果。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明涉及到的長鏈二元酸合成相關(guān)ω-氧化代謝途徑；
[0018] 圖2為本發(fā)明涉及到的長鏈二元酸降解相關(guān)β -氧化代謝途徑；
[0019] 圖3為本發(fā)明涉及到的啟動子替換流程圖；
[0020] 圖4為HPLC分析DC12發(fā)酵生產(chǎn)的長鏈二元酸；
[0021] 圖5為HPLC分析TDTC027發(fā)酵生產(chǎn)的長鏈二元酸。
[0022] 本發(fā)明的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其分類命名為假絲酵母菌（Candida sp.) TDTC027 ;其保藏機構(gòu)為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地 址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期為2014年3 月18日，保藏號編號為：CGMCC No. 8931。
【具體實施方式】
[0023] 本發(fā)明序列表中序列的名稱如下：序列I :Prol ;序列2 :Pro2 ;序列3 :Pro3 ;序列 4 :Pro4 ;序列 5 :Pro_U ;序列 6 :Pro_D ;序列 7 :CYP promoter ;序列 8 :CandidaA05093 ;序列 9 ：CandidaA09561〇
[0024] 以下實施例中觀察到的菌落及菌體形態(tài)歸納如下：
[0025] 固體培養(yǎng)基平板上，菌落奶酪狀，表面光滑，乳白色，飽滿凸起，菌落直徑約為2mm。 酵母樣單細胞，大小約為10x6 μm。大多情況下，以酵母樣單細胞形式，同時會有假菌絲體 形成，如在某些生長階段或某種外界條件刺激下，假菌絲比例會顯著增加。
[0026] 以下實施例中使用了下面所列的培養(yǎng)基：
[0027] 1、YPD培養(yǎng)基，其配方為：1%的酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固體培養(yǎng)基， 加入2%瓊脂粉。上述百分比為質(zhì)量體積百分比，即每100毫升培養(yǎng)基所需該組分的克數(shù)。 若要添加抗生素，液體培養(yǎng)基在使用時加入至相應終濃度。固體培養(yǎng)基在高壓滅菌后冷卻 至50攝氏度左右時，加入抗生素至相應終濃度，混勻后立刻倒如無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固 后倒置，放于4攝氏度冰箱，兩周內(nèi)使用。
[0028] 2、種子培養(yǎng)基的配方：酵母膏1~8g/L，玉米楽；1~8g/L，鹿糖5~25g/L， KH2P044~12g/L，尿素0· 5~4g/L，重蠟40~70g/L，121°C滅菌30分鐘。其中，蔗糖和尿 素分開單獨ll〇°C滅菌20分鐘，滅菌后再合并混勻。
[0029] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方：酵母膏1~8g/L，玉米漿1~8g/L，蔗糖5~30g/L， KH2P044 ~15g/L，尿素 0· 5 ~4g/L，KN035 ~15g/L，NaC10. 5 ~2. 5g/L，121Γ滅菌 30