一株表達果膠酯酶的釀酒酵母工程菌及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株表達果膠酯酶的釀酒酵母工程菌及其應用，特別是一株在細胞表 面錨定表達果膠酯酶的釀酒酵母菌株及其應用，屬于發(fā)酵工程領域。
【背景技術(shù)】
[0002] 化石燃料的日漸枯竭和全球范圍內(nèi)的環(huán)境保護要求，為燃料酒精產(chǎn)業(yè)帶來了很好 的發(fā)展機遇。燃料酒精是一種可再生的清潔能源，在汽油中添加一定比例的酒精，能夠顯著 降低汽車尾氣對環(huán)境的污染。我國是繼美國、巴西后的世界第三大燃料酒精主產(chǎn)國，年產(chǎn)量 達151. 8萬噸，并逐年增產(chǎn)。淀粉質(zhì)原料是生產(chǎn)燃料酒精的主要原料，原料中膠體、果膠質(zhì) 等粘性物質(zhì)較多，高濃度發(fā)酵時醪液的粘度很大，發(fā)酵液傳質(zhì)傳熱能力差，嚴重影響酶的作 用效果和釀酒酵母代謝活動，影響乙醇產(chǎn)量。醪液粘度高還會堵塞輸送管道、增加設備運轉(zhuǎn) 負擔，提高后期固液分離的處理難度，給酒精的濃醪發(fā)酵帶來困難。
[0003] 果膠質(zhì)是植物細胞壁的重要組成部分，與纖維素、半纖維素以及某些伸展蛋白相 互交聯(lián)，起著支撐細胞結(jié)構(gòu)的作用，它也是細胞間質(zhì)的填充劑，影響細胞間的粘連和組織的 硬度。果膠酯酶是果膠酶的一種，在紡織、造紙、污水處理等行業(yè)都有應用，在食品工業(yè)特別 是果蔬加工中應用較多，果膠酯酶可以保持果粒的完整性，有利于果汁的過濾和濃縮，提高 出汁率。果膠酯酶還可以用于酶法制備低甲基果膠，低甲氧基果膠食品具有含糖少、熱量低 等特點，符合健康飲食的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了首先一株表達果膠酯酶的釀酒酵母工程菌，是融合表達了果膠酯酶 的編碼基因 PE和α -凝集素的編碼基因 AGa 1，得到在細胞表面錨定表達果膠酯酶的釀酒 酵母工程菌。
[0005] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述果膠酯酶的編碼基因 PE的核苷酸序列如 GenBank ΧΜ_001390469 所示。
[0006] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述α-凝集素的編碼基因 AGa 1的核苷酸序列如 GenBank Μ28164 所不。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，果膠酯酶的編碼基因 PE和α-凝集素的編碼基因 AG α 1通過釀酒酵母磷酸甘油激酶PGK啟動子在釀酒酵母基因組中整合表達；以alpha因 子信號肽指導蛋白質(zhì)的定位。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，果膠酯酶的編碼基因 PE和α-凝集素的編碼基因 AGa 1通過帶有釀酒酵母磷酸甘油激酶PGK啟動子、G418抗性基因、用于同源整合位點的序 列的載體PMD18-T整合到釀酒酵母基因組中進行整合表達。
[0009] 所述釀酒酵母工程菌的果膠酯酶酶活為2. 6U/g濕菌體。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種利用上述釀酒酵母工程菌生產(chǎn)酒精的方法，是以淀粉質(zhì)原料 配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接種所述釀酒酵母工程菌，靜止發(fā)酵。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，是以木薯粉或/和玉米粉配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接種所 述釀酒酵母工程菌，靜止發(fā)酵。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述以木薯粉或/和玉米粉配制發(fā)酵培養(yǎng)基的方法 為：按1:3 (g/mL)的比例將木薯粉或/和玉米粉/與去離子水混合，調(diào)pH至6. 0,加入IOU/ g耐高溫α淀粉酶，加熱料液至95°C，維持2h ;降至室溫后調(diào)pH至4. 5,添加去離子水以彌 補水分損失。高壓蒸汽滅菌，降溫后加入130U/g糖化酶和0. 05%的尿素。
[0013] 本發(fā)明所提供的釀酒酵母工程菌，在以木薯粉或/和玉米粉為原料的同步糖化發(fā) 酵產(chǎn)酒精時，生長速度高于出發(fā)菌株，同時酒精產(chǎn)量相較出發(fā)菌株提高了 2. 2%。更為重要 的是釀酒酵母工程菌發(fā)酵過程中，表面展示的果膠酯酶活性能夠有效降解物料中的果膠物 質(zhì)，從而顯著降低發(fā)酵液粘度。以發(fā)酵12h為例，重組酵母的發(fā)酵液粘度為120mPa. s，相比 出發(fā)菌株的發(fā)酵液粘度145mPa. s，降低了 20. 8%，粘度的降低有利于酶的作用和釀酒酵母 代謝，還可以降低設備負擔，節(jié)約能耗。
【附圖說明】
[0014] 圖1為帶信號肽的果膠酯酶基因 PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒pMGK-AG-PE酶切產(chǎn)物電泳 圖
[0015] 圖2為釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的染色體DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖
[0016] 圖3為釀酒酵母工程菌PE發(fā)酵過程中的葡萄糖和酒精變化圖
[0017] 圖4為釀酒酵母工程菌PE發(fā)酵的過程中發(fā)酵液的粘度變化
【具體實施方式】
[0018] 果膠酯酶的酶活的測定：采用堿滴定法，具體操作：將2. 5mL 1 %的果膠溶液37°C 預熱1011^11，加入50(^1^待測酶液，37°(：反應301^11，煮沸151^11滅活，以0.02111〇1噸-1恥0!1 滴定至pH 8. 0。酶活定義為：在37°C、pH 5. 0條件下，每分鐘作用果膠產(chǎn)生1 μ mol羧基所 需的酶量定義為1個酶活力單位。
[0019] 種子培養(yǎng)基配方如下：2%葡萄糖，0.85%酵母粉，0. 13%氯化銨，0.01%硫酸鎂， 0. 006 %氯化|丐，115 °C高壓蒸汽滅菌。
[0020] 發(fā)酵培養(yǎng)基配制方法如下：按l:3(w/v)的比例將甘薯粉與去離子水混合，調(diào)pH至 6. 0,加入耐高溫α淀粉酶（l〇U/g)。加熱料液至95°C，維持2h。降至室溫后調(diào)pH至4. 5， 添加去離子水以彌補水分損失。121°C高壓蒸汽滅菌，降溫后加入糖化酶（130U/g)和尿素 (終濃度0.05% )。
[0021] 發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗和酒精的分析：用高效液相色譜分析，色譜柱為Aminex HPX-87H離子交換柱，流動相為lOmmol/L H2SO4，流速0. 8mL/min，柱溫65°C ;發(fā)酵初始的總 糖采用酸水解法測定，DNS法測還原糖，以公式：發(fā)酵效率=實測發(fā)酵酒精濃度八初始總糖 濃度*0. 511) *100%計算發(fā)酵效率。
[0022] 實施例1構(gòu)建釀酒酵母工程菌（Saccharomyces cerevisiae)PE
[0023] 1、含有果膠酯酶編碼基因的重組質(zhì)粒pMGK-AG-PE的構(gòu)建
[0024] 按照試劑盒操作步驟，用試劑盒提取黑曲霉的總RNA并以此為模板，逆轉(zhuǎn) 錄合成一鏈cDNA，根據(jù)PE基因序列（GenBank號為ΧΜ_001390469)設計引物PEf : ATGGTTAAGTCAATTCTTGCATCCGT 和 PEr :TTAGTTGATGTAGCTAG，并以一鏈 cDNA 為模板，PCR 擴 增含不含自身信號肽的完整果膠酯酶基因，插入到載體PPIC9K的SnaBI位點，獲得重組質(zhì) 粒pPIC9k-PE。根據(jù)pPIC9K中的alpha因子信號肽的核苷酸序列設計上游引物PE1，根據(jù) PE基因序列（GenBank號為XM_001390469)，設計下游引物PE2,引入EcoR I酶切位點，引物 序列如下
[0025] 上游引物 PEl ：CCGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAA
[0026] 下游引物 PE2 ：CCGGAATTCTTAGTTGATGTAGCTAG,以重組質(zhì)粒 pPIC9k_PE 為模板，以 PEl和PE2為上下游引物，進行PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳， 電泳結(jié)果如圖2所示，得到一條約1270bp的特異性條帶，其大小與預期相同，表明擴增得到 含alpha因子信號肽的果膠酯酶基因 sPE。
[0027] 將α -凝集素的編碼基因 AG a 1的PCR擴增產(chǎn)物片段和載體pMGK用sal I酶切 后連接，獲得重組質(zhì)粒PMGK-AG。載體pMGK的構(gòu)建，是以pMD18-T為出發(fā)載體，在sal I 位點插入釀酒酵母磷酸甘油激酶PGK啟動子、在Not I位點插入G418抗性基因，在Nde I 位點插入一