一株具高抗氧化活性的植物乳桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一株具高抗氧化活性的植物乳桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 生物氧化是機體新陳代謝的重要生理過程，但此過程中會產(chǎn)生自由基等各種活性 氧分子（ROS)。盡管正常情況下，機體存在著自由基清除系統(tǒng)，但如果機體受到某些因素影 響，自由基清除系統(tǒng)出現(xiàn)故障導致體內自由基過度產(chǎn)生，則會作用于機體內的蛋白質、核酸 等分子，造成細胞損傷，給機體健康帶來很大威脅。通過膳食中補充抗氧化物質可以增強機 體的抗氧化能力，但許多化學合成的抗氧化劑存在安全問題。乳酸菌作為腸道常駐菌群，可 以直接在機體氧化損傷的重點部位-腸道發(fā)揮抗氧化作用，維持腸道處于氧化還原平衡狀 態(tài)。并且乳酸菌在腸道定植后還能不斷增殖，產(chǎn)生更多能夠發(fā)揮抗氧化作用的乳酸菌，源源 不斷地在腸道扮演ROS清道夫的角色。因此乳酸菌的抗氧化作用與傳統(tǒng)的抗氧化劑相比有 更多的優(yōu)勢。
[0003] 近些年許多體外和體內實驗已證明一些乳酸菌具有良好的抗氧化活性，Li等對分 離自中國傳統(tǒng)發(fā)酵食物中的11株植物乳桿菌體內外抗氧化能力進行了研究，發(fā)現(xiàn)植物乳 桿菌C88乳酸菌的抗氧化活性已經(jīng)得到體內及體外試驗的證實。能較好地緩解D-半乳糖 誘導的小鼠氧化應激；Kullisaar等利用人體實驗表明發(fā)酵乳桿菌ME-3具有抗氧化活性。
[0004] 本研究從市售泡菜中分離得到的7株菌并對其進行抗氧化性能篩選，篩選到一株 具強抗氧化性能的植物乳桿菌，分析其抗氧化機理，并對其耐受性進行研究，為將乳酸菌的 抗氧化作用應用于功能性食品或保健品的開發(fā)和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是篩選出一株高抗氧化活性植物乳桿菌，分析其抗氧化機理， 并對其耐受性進行研究，為將該菌的抗氧化作用應用于功能性食品或保健品的開發(fā)和生產(chǎn) 奠定基礎。
[0006] 本發(fā)明提供一株具高抗氧化活性的植物乳桿菌，該菌命名為植物乳桿菌 BLCC2-0015 (Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，保藏編號為 CCTCC N0:M2015126,保 藏日期為2015年3月18日，保藏于中國武漢，武漢大學，中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0007] 本發(fā)明還提供一種上述植物乳桿菌BLCC2-0015,在制備用于機體抗氧化的食品或 保健品中的應用。
[0008] 本發(fā)明再提供一種用于機體抗氧化的食品或保健品，其特征在于，包括上述植物 乳桿菌 BLCC2-0015。
[0009] 進一步的，將所述植物乳桿菌BLCC2-0015制備成菌粉與載體混勻即可。
[0010] 進一步的，所述菌粉通過以下步驟得到的：
[0011] 取植物乳桿菌BLCC2-0015凍干粉菌種；
[0012] 將所述凍干粉菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上活化；
[0013] 取活化后的固體斜面培養(yǎng)基，在無菌條件下接種于種子液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到 一級種子液；
[0014] 將所述一級種子液接種于另一種子液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到二級種子液；
[0015] 將所述二級種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵；
[0016] 待所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵液黏度達12000-15000cP時，收集發(fā)酵液；
[0017] 將所述發(fā)酵液干燥得到菌粉成品。
[0018] 進一步的，所述發(fā)酵液干燥得到菌粉成品的步驟為將所述發(fā)酵液離心并用清水清 洗，如此重復2-3遍后冷凍干燥，粉碎，即為菌粉成品；或發(fā)酵結束后，將所述發(fā)酵液立即噴 霧干燥，得菌粉成品。
[0019] 進一步的，所述種子液體培養(yǎng)基包括：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L 和酵母膏5g/L，調節(jié)pH至5. 5-6. 5,115°C條件下滅菌20min ;所述得到一級種子液和所述 得到二級種子液的培養(yǎng)條件均為30-37°C靜置培養(yǎng)12-16h。
[0020] 進一步的，所述固體斜面培養(yǎng)基為所述種子液體培養(yǎng)基中添加1. 5-2. 0%的瓊脂 粉；菌種活化條件為30-37°C培養(yǎng)20-30h。
[0021] 進一步的，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏IOg/ U酵母膏5g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L、磷酸氫二鉀5g/L、硫酸鎂0. 5g/L、硫酸錳 0. 2g/L和吐溫-801mL/L，使用時，調節(jié)pH至5. 5-6. 5 ;所述發(fā)酵條件為30-37°C條件下，靜 置培養(yǎng)10-24h。
[0022] 進一步的，所述一級種子液和二級種子液的接種量均為1-5%。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的具高抗氧化活性的植物乳桿菌從眾多乳酸菌中 篩選得到的，不僅具高抗氧化活性，還可以具有良好的耐酸耐膽鹽特性。將該菌菌粉制成機 體抗氧化食品或保健品，直接食用或沖服飲用，使用方便，可增強機體免疫力。
[0024] 本發(fā)明提供的可用于抗氧化的乳桿菌命名為植物乳桿菌 BLCC2-0015 (Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，已于 2015 年 3 月 25 日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC N0:M2015126。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明植物乳桿菌BLCC2-0015的生長曲線；
[0026] 圖2為菌株BLCC2-0015的菌體形態(tài)（油鏡觀察）；
[0027] 圖3為菌株BLCC2-0015PCR擴增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳結果；
[0028] 圖4為菌株BLCC2-0015的系統(tǒng)進化分析；
[0029] 圖5為菌株BLCC2-0015對膽鹽耐受性結果。
【具體實施方式】
[0030] 下文將結合具體附圖詳細描述本發(fā)明具體實施例。應當注意的是，下述實施例中 描述的技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達 到更好的技術效果。
[0031] 實施例1
[0032] 1、乳酸菌的分離純化
[0033] 取適量泡菜至80mL MRS培養(yǎng)基中37°C富集培養(yǎng)20h，取培養(yǎng)液于含0&〇)3的MRS 瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37°C恒溫靜止培養(yǎng)24h后，挑取培養(yǎng)基上具有明顯透明圈的單菌落，經(jīng) 革蘭氏染色和接觸酶反應，挑出革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性菌株斜面保存。
[0034] 2、具有抗氧化活性乳酸菌的篩選
[0035] 2. 1乳酸菌的培養(yǎng)及發(fā)酵液的制備
[0036] 乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24h，6000r/min，4°C離心10min，收集上清液 即為發(fā)酵液。
[0037] 2. 2乳酸菌在不同濃度H2O2溶液中的耐受能力測定
[0038] 在IOOmL滅菌的三角瓶中加入60mL的MRS液體培養(yǎng)基，分別添加過氧化氧溶液， 使培養(yǎng)基中的起始H2O2濃度分別為0. 4mmol/L、0. 7mmol/L和1.0 mmol/L，并按1 %的接種 量接入分離所得的菌株培養(yǎng)液，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取樣測定值，觀察每株菌 在不同起始過氧化氫濃度下的生長趨勢，挑選具有過氧化氫耐受性較高的菌株進行后續(xù)實 驗。
[0039] 2. 3 DPPH清除率的測定
[0040] 2mL DPPH自由基甲醇溶液（0. 2mmol/L)中，加入2mL發(fā)酵液，室溫避光條件下反應 30min后，3000rpm離心10min，收集上清液于517nm測吸光度，以純凈水替代乳酸菌發(fā)酵液 反應液作為空白對照，以純凈水與甲醇1:1比例混合液調零。
[0041] DPPH 自由基清除率=[1-A517(樣品）/A517(空白）]X100%
[0042] 2. 4羥自由基· OH清除率的測定
[0043] ImL 的 PBS (pH = 7. 4)中加入 ImL 鄰菲羅啉（2. 5mmol/L)、ImL FeSO4 (2. 5mmol/L)、 H2O2 (濃度為20mmol/L)，再加入0. 5mL樣品，37°C恒溫水浴反應I. 5h后，在536nm處測吸光 值。
[0044] 清除率（％ ) = [ (A2-A1) AA0-A1) ] X 100 %
[0045] 注：A。為不含樣品和H 202;A i為不含樣品