一種轉(zhuǎn)氨酶及其在合成西他列汀中間體中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)氨酶，含有該酶編碼基因的重組 表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，表達(dá)的重組酶和該重組酶的制備方法，以及該轉(zhuǎn)氨酶作為催 化劑在不對(duì)稱合成西他列汀中間體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是由于胰島素分泌改變，導(dǎo)致胰島素缺乏及作用減弱，或者胰島素活性降 低，或者在兩者共同影響下，出現(xiàn)的代謝性疾病，以高血糖為特征，并同時(shí)伴有蛋白質(zhì)、糖 及脂肪的代謝紊亂。糖尿病及其并發(fā)癥對(duì)人類健康的危害程度居心血管疾病、腫瘤之后的 第三位，成為危害人類健康的重要疾病。國際糖尿病聯(lián)合會(huì)預(yù)計(jì)，到2030年，患病總?cè)藬?shù) 將超過4. 35億人。而我國已成為世界糖尿病患病率增長速度最快的國家之一，目前約有 4000萬糖尿病患者，人數(shù)僅次于印度，居世界第二位。在糖尿病的四種類型中，II型糖尿 病占90%以上，多見于30歲以上的中老年人，病因主要是由于機(jī)體對(duì)胰島素不敏感。在 臨床上治療II型糖尿病的藥物中，磺酰脲類胰島素分泌促進(jìn)劑、雙胍類胰島素敏感性增強(qiáng) 劑、α -葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類胰島素增敏劑、非磺酰脲類胰島素分泌促進(jìn)劑等 雖然降糖作用較為理想，但均有一定的副作用影響患者堅(jiān)持用藥，達(dá)不到較好的血糖控制 效果。西他列汀磷酸鹽（Sitagliptin phosphate)是2006年FDA批準(zhǔn)上市的第一個(gè)二肽 基酶-IV(DPP-4)抑制劑，用于治療II型糖尿病，其單用或與二甲雙胍、吡格列酮合用都有 明顯的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反應(yīng)少。它主要通過抑制DPP-4對(duì)胰高血 糖素樣肽-I(GLP-I)和糖依賴性胰島素釋放肽（GIP)的降解以達(dá)到治療的目的，輕度增加 GLP-I含量并減弱GLP-I代謝物的拮抗作用，所以在有效發(fā)揮降糖作用的同時(shí)不會(huì)引起因 GLP-I含量過高而引起的惡心嘔吐等副作用；同時(shí)，GIP促進(jìn)胰島素分泌具有血糖依賴性， 故能大大降低口服降糖藥導(dǎo)致的低血糖副作用的發(fā)生率。西他列汀磷酸鹽由默克公司開 發(fā)，于2006年8月及10月分別被墨西哥衛(wèi)生部及美國FDA批準(zhǔn)為治療II型糖尿病的藥物， 商品名為捷諾維（Januvia)，目前已經(jīng)在全世界60多個(gè)國家批準(zhǔn)使用，2012年銷售額已達(dá) 40. 86億美元，同比增長23%。因此，西他列汀磷酸鹽是屬于國際最新且附加值極高的"重 磅炸彈"。
[0003] 西他列汀合成中的關(guān)鍵步驟是手性氨基中間體的構(gòu)建。美國專利US6699871公開 了一種西他列汀的合成方法，采用手性源來誘導(dǎo)出手性的α -氨基酸，而后通過重氮化反 應(yīng)產(chǎn)生β-氨基酸來構(gòu)建所需的手性中心。該路線所需的原料成本相對(duì)較高，反應(yīng)較為麻 煩，且產(chǎn)業(yè)化過程中工藝過程和產(chǎn)品質(zhì)量都難以控制。
[0004]
[0005] 國際專利W02004087650公開了默克公司關(guān)于西他列汀的合成路線，利用手性釕 催化劑對(duì)酮進(jìn)行不對(duì)稱氫化構(gòu)建手性醇，然后將手性醇轉(zhuǎn)化成手性胺。該合成方法中，需要 用到釕催化的不對(duì)稱氫化，催化劑價(jià)格昂貴，總收率只有52%，工藝中用到高壓氫氣，立體 選擇性也不高。
[0007] 國際專利W02005003135公開了默克公司開發(fā)的西他列汀的合成方法，以S-苯甘 氨酰胺作為手性助劑來誘導(dǎo)催化氫化而合成手性胺。該路線需要兩次催化氫化，第一次所 用的鉬催化劑價(jià)格昂貴，第二次脫保護(hù)時(shí)需要用大量的Pd(OH) 2-C催化劑，成本較高，ee值 為96 %，需要進(jìn)一步重結(jié)晶。
[0008]
[0009] 國際專利W02007050485公開了默克公司關(guān)于西他列汀的合成方法，采用了手性 銠催化劑對(duì)烯胺的不對(duì)稱氫化來合成手性胺，產(chǎn)率達(dá)到84%，ee值94%，但該方法需要用 昂貴的銠手性催化劑，去除與回收也較為困難。
[0011] 美國專利US8293507公開了 Codexis公司對(duì)節(jié)桿菌來源的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行改造得到的 生物催化劑代替上述工藝中的銠催化劑，轉(zhuǎn)氨化產(chǎn)物ee值達(dá)到99 %，底物投料100g/L。但 是由于底物水溶性差，需要添加高達(dá)50%的DMSO助溶，使得產(chǎn)品的后處理損失較大，DMSO 的溶劑殘余較高，回收困難，成本較高。
[0012] 中國專利CN102838511公開了浙江海翔藥業(yè)關(guān)于西他列汀中間體的生產(chǎn)方法，采 用格式試劑對(duì)手性環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行親核取代，而后用氰化物進(jìn)行取代水解合成β -羥基 酸，該方法總收率僅40 %，而且由于采用劇毒氰化物，應(yīng)用受限。
[0013]
[0014] 中國專利CN102485718公開了浙江海翔藥業(yè)關(guān)于西他列汀合成的路線，通過采用 甲硫氨酸作為手性源進(jìn)行合成，但是產(chǎn)率僅14%，即使以2, 4, 5-三氟溴苯計(jì)也僅55%。
[0016] 中國專利CN103014081公開了蘇州漢酶公司利用轉(zhuǎn)氨酶將3-羰基-4-(2, 4, 5-三 氟苯基）-丁酸甲酯轉(zhuǎn)化為R-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基）-丁酸甲酯，但是并沒有公開 具體轉(zhuǎn)氨酶的序列以及克隆方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 針對(duì)已報(bào)道的不對(duì)稱合成西他列汀及其中間體的反應(yīng)中產(chǎn)率偏低、立體選擇性 不佳、催化劑價(jià)格昂貴、溶劑難以回收等問題，本發(fā)明提供了一種催化活性高、對(duì)映選擇性 強(qiáng)、底物耐受性與溶劑耐受性好的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行酶催化合成R-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯 基）_ 丁酸甲酯，進(jìn)而進(jìn)一步合成西他列汀的酶-化學(xué)合成方法。還提供了該轉(zhuǎn)氨酶的基 因，含有該基因的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體及其高效制備方法，以及該轉(zhuǎn)氨酶在催化 羰基底物不對(duì)稱轉(zhuǎn)氨合成西他列汀中間體中的用途。
[0018] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案以解決上述技術(shù)問題：
[0019] 本發(fā)明的第一方面提供了一種分離的蛋白質(zhì)，其是如下（a)或（b)的蛋白質(zhì)：
[0020] (a)由SEQ ID No :2、4、6、8或10所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0021] (b)在（a)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有 轉(zhuǎn)氨酶活性的由（a)衍生的并和（a)的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白質(zhì)，特別是 下文中所提到的那些氨基酸取代。
[0022] SEQ ID No :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)來源于分支桿菌（Mycobacterium vanbaalenii)PYR_l，具有轉(zhuǎn)氨酶的功能，是一種新的轉(zhuǎn)氨酶。
[0023] SEQ ID No :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)可以從分支桿菌PYR-I中分離獲 得，也可以從重組表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以人工合成獲得。
[0024] 兩條氨基酸序列或兩條核苷酸序列之間的同一性均可通過本領(lǐng)域常用的算法得 至1J，優(yōu)選采用NCBI Blastp和Blastn軟件根據(jù)默認(rèn)參數(shù)計(jì)算得到。
[0025] SEQ ID No :2所示的轉(zhuǎn)氨酶和節(jié)桿菌來源的ATA117之間的氨基酸序列同一性為 52%。本發(fā)明中氨基酸序列如SEQ ID No :2所示的轉(zhuǎn)氨酶與已知轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列的同 一'I"生低于70%，具有顯著差異性。
[0026] 蛋白質(zhì)（b)是在（a)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且 具有轉(zhuǎn)氨酶活性的由（a)衍生的并和（a)的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白質(zhì)。其 中，所述的"幾個(gè)"是指2個(gè)至小于100個(gè)，更佳地小于30個(gè)，最佳地小于10個(gè)。比如添加 一個(gè)外分泌信號(hào)肽的融合蛋白，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)這樣的融合蛋白同樣具有轉(zhuǎn)氨酶活性。也就是 說，只要由（a)衍生的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)氨酶活性，且衍生方式如上所述，都可以達(dá)到本發(fā)明的 發(fā)明目的。根據(jù)本發(fā)明，在如SEQ ID No :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)（a)分子中進(jìn)行4、10、 15、20個(gè)氨基酸殘基的突變得到SEQ ID N〇:4、6、8、10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，也屬于蛋 白質(zhì)（b);或?qū)EQ ID N〇:2、4、6、8、10進(jìn)行組合，或進(jìn)行1-20個(gè)氨基酸殘基的突變，也可 獲得上述蛋白質(zhì)（b)，但仍然保持轉(zhuǎn)氨酶活性。
[0027] 在篩選獲得SEQ ID No :2所示野生型轉(zhuǎn)氨酶的基礎(chǔ)上，發(fā)明人還對(duì)野生型酶進(jìn)行 了改造，將活性中心一些位點(diǎn)的氨基酸殘基突變?yōu)槠渌陌被釟埢?，以進(jìn)一步強(qiáng)化該酶 的催化性能。所述的活性中心定義為底物結(jié)合位點(diǎn)附近大約丨0-!2.4的球形空間。
[0028] 優(yōu)選地，（b)蛋白質(zhì)是在（a)的氨基酸序列的第56、68、69、72、76、96、129、131、 143、157、206、216、222、230、243、276、289、291、295、304 位氨基酸殘基中的一位或多位經(jīng)過 取代且具有轉(zhuǎn)氨酶活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0029] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，SEQ ID No : 2所述的氨基酸序列的第72位的亮氨酸取 代為半胱氨酸，第76位的纈氨酸取代為丙氨酸，第129位的苯丙氨酸取代為纈氨酸，以及第 291位的丙氨酸取代為甘氨酸所得的SEQ ID No :4所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)對(duì)底物具 有一定的活性。
[0030] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，SEQ ID No :2所述的氨基酸序列的第69位的組氨酸取 代為亮氨酸，第72位的亮氨酸取代為半胱氨酸，第76位的纈氨酸取代為丙氨酸，第129位 的苯丙氨酸取代為纈氨酸，第143位的甘氨酸取代為異亮氨酸，第206位的絲氨酸取代為纈 氨酸，第216位的蘇氨酸取代為異亮氨酸，第230位的脯氨酸取代為丙氨酸，第289位的蘇 氨酸取代為丙氨酸，以及第291位的丙氨酸取代為甘氨酸所得的SEQ ID No :6所示氨基酸 序列組成的蛋白質(zhì)對(duì)底物的活性有了很大的提高。
[0031] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，SE