枯草桿菌酶變體的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2003年11月05日、申請?zhí)枮?201010167560. 8"、名稱 為"枯草桿菌酶變體"的發(fā)明專利申請（其為申請日為2003年11月05日、申請?zhí)枮?"200380102792. 3"、國際申請?zhí)枮镻CT/DK2003/000756)的分案申請）的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及在一種或多種特性上與親本枯草桿菌酶不同的新枯草桿菌酶 (subtilase)變體，所述特性包括：洗滌性能、熱穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性或催化活性。本發(fā)明的 變體適用于例如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣洗滌劑組合物和洗盤組合物，包括自動洗盤 組合物中。本發(fā)明還涉及編碼所述變體的經(jīng)分離DNA序列、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生 和使用本發(fā)明變體的方法。而且，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明變體的清潔和洗滌劑組合物。
【背景技術(shù)】
[0003] 在洗滌劑工業(yè)中，酶已在洗滌制劑中使用了 30年以上。用于這些制劑的酶包括蛋 白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶和其它酶或它們的混合物。商業(yè)上最為重要的酶是蛋白酶。
[0004] 數(shù)量不斷增長的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程化變體，如 Durazym?, Relase?, Alealase?, Savirtase?? Primase?. Duralase?, Espease氣 Ovozyme? 和 Kannase、： (Novozymes A/S)、Maxatase?、Maxacal?、Maxapem?、Properase?、 Purafect?、Purafect 0xP?、FN2?、FN3? 和 FM ?(Genencor International, Inc·)。而且， 本領(lǐng)域描述了許多蛋白酶變體。WO 99/27082中給出了現(xiàn)有技術(shù)中蛋白酶變體的完整列表。 [0005] 雖然已描述了大量有用的蛋白酶變體，但是對于許多工業(yè)應(yīng)用，例如洗衣或硬表 面清潔而言，仍需要新的改進(jìn)的蛋白酶或蛋白酶變體。因此，本發(fā)明的一個目的是提供改進(jìn) 的枯草桿菌酶變體用于此類目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及如下的枯草桿菌酶變體：
[0007] a)其至少包含在62位、68位、97位、98位、99位、106位、131位、170位、245位、 252 位的一處或多處對氨基酸殘基 K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、T 之一 的插入、替代或缺失與至少一個下列修飾的組合：
[0008] * 0AQSVPWG ;A1T，V ;Q2L ;S3T，A，L ;V4L，A ;I8V，T ;S9G，D，R，K，L，V ;R10H，K ;V11A ; Q12D ；
[0009] A13V ;P14S，T，D，A，M，V，K，Q，L，H，R，I ;A15M，T ;A16P ;H17R ;N18S，H ;R19W，K，L， F，G，I ;
[0010] G20 *，R，A ;L21F，LP，LW，LA，LG ;T22S，A，K，TV，TG，TL，TW，TV，G，L，TY ;G23S ; S24P ；K27R,
[0011] V28I ；V30I ；I35T, V ；T38S ；P40L ；N43D ；R45H, K ；G46D ；A48T ；S49N ；F50S ；V51A, I,
[0029] N296K ;E271A ;T274S，L，A，R 或
[0030] b)其至少包含一個下列組合變體：
[0031] A108T+L111V ；L124I+S125A ；P129S+S130AT ；L96LA+A151G+V203A ；
[0032] S49N+V203L+N218D ；S3T+A16P+R45C+G100S+A230V ；I8V+R19K+V139I ；
[0033] N76D+A174AL+A194P+A230V ;N185R ;N62NE ;H120Q+Q137E，G61GE，G61GS，G100L，
[0034] A133D，V68A，N123D，LI I 1F + Y263H，Vl 1A + G61GE + V227A + S240F， A133E+S144K+N218D，
[0045] c)其至少包含在位置68處的一種或多種修飾，其中所述修飾包含：對選自K、H、 R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S和T的氨基酸殘基進(jìn)行缺失、插入和/或替代。
[0046] 第二方面，本發(fā)明涉及如下的枯草桿菌酶變體：
[0047] a)其包含對一個或多個下列修飾
[0048] X62D，XD，XE，XG，DE

[0081] 進(jìn)行的組合。
[0082] 第三方面，本發(fā)明涉及包含下面表1中公開的至少一處改變的枯草桿菌酶變體：
[0083] 表1 :具有一處或多處改變的本發(fā)明枯草桿菌酶變體：
[0084]











[0096] 其中
[0097] (a)表1的變體顯示蛋白酶活性，且
[0098] (b)每一位置都對應(yīng)于圖1和SEQ ID NO: 1所示的枯草桿菌蛋白酶BPN'氨基酸序 列的位置。
[0099] 第四方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的經(jīng)分離多核苷酸。
[0100] 第五方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的經(jīng)分離多核苷酸的表達(dá)載體。
[0101] 第六方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。
[0102] 第七方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明枯草桿菌酶變體的方法，其中在有利于該 變體表達(dá)和分泌的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主，并回收該變體。
[0103] 第八方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明變體的清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選地為包含本 發(fā)明變體的洗衣或洗盤組合物。
[0104] 第九方面，本發(fā)明涉及包含下面表1I中公開的至少一處改變的枯草桿菌酶變體：
[0105] 表1I :具有一處或多處改變的本發(fā)明枯草桿菌酶變體：
[0106]



[0110] 其中
[0111] (a)表1I的變體顯示蛋白酶活性，且
[0112] (b)每一位置都對應(yīng)于圖1和SEQ ID NO: 1所示的枯草桿菌蛋白酶BPN'氨基酸序 列的位置。
[0113] 第十方面，本發(fā)明涉及包含N252D和N252M中的一種改變的枯草桿菌酶變體。
[0114] 第^^一方面，本發(fā)明涉及這樣的枯草桿菌酶變體，其包含[1孔、1、￥、4、3;11751^、 1、￥、4、3和12221^、1、￥、4、3中的一個或多個改變與上述表1和11所列的枯草桿菌酶變體 的組合。
[0115] 關(guān)于序列比對和編號參考圖1，該圖顯示在枯草桿菌蛋白酶BPN'（a) (BASBPN) 和枯草桿菌蛋白酶309(b) (BLSAVI)之間的序列比對。在本專利申請中此序列比對 (alignment)用作對殘基進(jìn)行編號的參照。
[0116] 定義
[0117] 在更詳細(xì)地討論本發(fā)明之前，首先定義以下的術(shù)語和約定。
[0118] 對氨基酸和核酸命名法的詳細(xì)描述，我們參照WO 00/71691的始于第5頁的部分， 此處引用作為參考。
[0119] 奪體名稱的命名法和約宙
[0120] 在描述本發(fā)明產(chǎn)生的或考慮的多種枯草桿菌酶變體時，采用以下的命名法和約定 以易于參照：
[0121] 首先通過將分離的酶或親本酶與枯草桿菌蛋白酶BPN'（BASBPN)比對來定義參考 框。
[0122] 可以由GCG軟件包9. 1版的GAP程序?qū)ψ凅w進(jìn)行編號而獲得序列比對，其間使用 了以下參數(shù)：缺口（gap)創(chuàng)建罰分=8,缺口延伸罰分=8,且所有的其它參數(shù)保持為它們的 默認(rèn)值。
[0123] 另一種方法是使用枯草桿菌酶之間的已知公認(rèn)比對，如在WO 91/00345中所示的 序列比對。在大部分情況下，這些差異并不重要。
[0124] 由此，可以相對BASBPN(SEQ ID N0:1)定義許多缺失和插入。在圖1中，枯草桿菌 蛋白酶309(SEQ ID N0:2)與BASBPN相比，在位置36、58、158、162、163和164位有6處缺 失。這些缺失在圖1中用星號（*)表示。
[0125] 對于通過遺傳操作而導(dǎo)入多肽中的修飾的命名法的詳細(xì)描述，我們參照WO 00/71691的第7-12頁，此處引用作為參考。
[0126] 蛋白酶
[0127] 斷裂蛋白質(zhì)底物中的酰胺鍵的酶歸類為蛋白酶，或（可互換地）肽酶（見Walsh，1979， 酉每反應(yīng)機理（Enzymatic Reaction Mechanisms). ff. H. Freeman and Company, San Francisco,第 3 章）。
[0128] 氨基酸位詈/殘基的編號
[0129] 如果沒有另外指出，本文所用的氨基酸編號對應(yīng)于枯草桿菌酶BPN'（BASBPN)序 列的氨基酸編號。對BPN'序列的詳細(xì)描述，參見圖1或Siezen等，蛋白質(zhì)工程（Protein Engng. )4(1991) 719-737。
[0130] 絲氨酸蛋白酶
[0131] 絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性位點存在必需的絲氨酸殘 基（White, Handler 和 Smith, 1973 "生物化學(xué)原理（Principles of Biochemistry), " 第 五版，McGraw-Hill Book公司，紐約，第271-272頁）。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量在 20, 000-45, 000道爾頓的范圍內(nèi)。它們被二異丙基氟磷酸酯抑制。它們水解簡單末端脂類， 且其活性與真核生物糜蛋白酶（也是一種絲氨酸蛋白酶）相似。一個更為狹義的術(shù)語，堿 性蛋白酶（包括一個亞組）反映某些絲氨酸蛋白酶的高pH最適值，為pH 9. 0-11.0(綜述 參見 Priest (1977)細(xì)菌學(xué)評論（Bacteriological Rev.) 41 :711-753)。
[0132] 枯草桿菌酶
[0133] Siezen 等，蛋白質(zhì)工程，4 (1991) 719-737 和 Siezen 等，蛋白質(zhì)科學(xué)（Protein Science) 6 (1997) 501-523提出絲氨酸蛋白酶的一個亞組，其暫稱為枯草桿菌酶 (subtilase)。它們是通過對170多個先前稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶 的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析而定義的?？莶輻U菌蛋白酶以前通常被定義為由革蘭氏陽性 細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等則為枯草桿菌酶的一個亞組。已鑒 定了大量的枯草桿菌酶，并已測定了許多枯草桿菌酶的氨基酸序列。對此類枯草桿菌酶及 其氨基酸序列的更詳細(xì)描述參見Siezen等（1997)。
[0134] 枯草桿菌酶的一個亞組，I-Sl或〃真〃枯草桿菌蛋白酶，包含"經(jīng)典的"枯草 桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168 (BSS168)、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草桿菌蛋白酶 Carlsberg (ALCALASE?，N0V0ZYMES A/S)和枯草桿菌蛋白酶 DY (BSSDY) 〇
[0135] Siezen等（引文同上）識別了枯草桿菌酶的另一亞組，I-S2或強堿性枯草 桿菌蛋白酶。亞組I-S2蛋白酶被描述為強堿性枯草桿菌蛋白酶并包括例如：枯草 桿菌蛋白酶 PB92 (BAALKP) ( MAXACAL?, Gist-Brocades NV)、枯草桿菌蛋白酶 309 ( SAVINASE?，： NOVOZYMES A/S)、枯草桿菌蛋白酶 147 (BLS147) ( ESPERASE， NOVOZYMES A/S)和堿性彈性蛋白酶 YaB(BSEYAB)。
[0136] 'tSAVINASEli"
[0137] SA\TN ASE/K由NOVOZYMES A/S銷售。它是來自遲緩芽孢桿菌（B. Lentus)的 枯草桿菌蛋白酶309，并且只在一個位置處（N87S)不同于BAALKP。SAVINASEi8:具有在 圖1和SEQ ID NO: 2中稱為b)的氨基酸序列。
[0138] 親本枯草桿菌酶
[0139] 術(shù)語"親本枯草桿菌酶"描述根據(jù)Siezen等（1991和1997)定義的枯草桿菌酶。 關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見以上"枯草桿菌酶"的描述。親本枯草桿菌酶也可以是從天然來源 分離的、并隨后在保留枯草桿菌酶特征的情況下經(jīng)過修飾的枯草桿菌酶。而且，親本枯草桿 菌酶還可以是通過如以下文獻(xiàn)所述的DNA改組技術(shù)制備的枯草桿菌酶：J. E. Ness等，自然 生物技術(shù)（Nature Biotechnology) ,17, 893-896 (1999)。術(shù)語"親本枯草桿菌酶"可另外稱 為"野生型枯草桿菌酶"。
[0140] 作為參考下表提供了此處所述多種枯草桿菌酶的簡稱，對于其它簡稱，參見 Siezen 等，蛋白質(zhì)工程（Protein Engng. )4(1991)719-737 和 Siezen 等，蛋白質(zhì)科學(xué) (Protein Science)6 (1997)501-523。
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