一種高效提取食用菌菌絲體營養(yǎng)生長階段rna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效提取食用菌菌絲體營養(yǎng) 生長階段RNA的方法。 技術(shù)背景
[0002] 食用菌不僅物美味鮮，而且低能量、低脂肪，并富含蛋白質(zhì)、膳食纖維和維生素等 營養(yǎng)素，正在發(fā)展成為繼植物性食品、動物性食品之外的第三類食品，即菌物性食品。此外， 食用菌還是功能性多糖、萜類化合物等多種天然產(chǎn)物的來源之一，在提高人體免疫功能，防 治多種慢性病和抗衰老等方面具有顯著的功效。因此，食用菌越來越受到廣大消費者的青 睞，市場需求量不斷增大。常見的食用菌栽培基質(zhì)主要由富含纖維素、木質(zhì)素的固形物（木 肩、棉籽殼、作物秸桿、中藥渣）加入適量的輔料（麩皮或米糠）再與水配制而成。
[0003] 近年來，盡管食用菌產(chǎn)業(yè)在我國發(fā)展迅速，國家對食用菌產(chǎn)業(yè)支持力度也逐年加 大，但基礎(chǔ)研究薄弱的現(xiàn)狀還沒有得到根本性的改變。傳統(tǒng)的研究手段已經(jīng)無法滿足當前 食用菌相關(guān)研究的需求。而分子生物學(xué)技術(shù)可以突破傳統(tǒng)研究方法的限制，將極大地促進 食用菌木質(zhì)纖維素降解的分子機制、食用菌子實體形成發(fā)育的調(diào)控機理、食用菌環(huán)境因子 響應(yīng)的分子機制、食用菌活性物質(zhì)及其合成代謝的分子基礎(chǔ)、食用菌遺傳多樣性分析及食 用菌鑒定與育種等領(lǐng)域的研究，而所有這些研究的基礎(chǔ)便是從食用菌菌絲體中獲取高質(zhì)量 的 RNA0
[0004] 常規(guī)的實驗手段是從液體培養(yǎng)基中的菌絲體、PDA培養(yǎng)基表面的菌絲體或者食用 菌的子實體中提取RNA，這些提取方法已經(jīng)比較成熟。然而，食用菌在栽培基質(zhì)（木肩、棉 籽殼、作物秸桿、中藥渣）上的生長分為兩個階段：即菌絲體營養(yǎng)生長階段和子實體生長階 段，而菌絲體營養(yǎng)生長階段是整個食用菌生長發(fā)育過程中最重要的階段。由于在菌絲體營 養(yǎng)生長階段，菌絲體和栽培基質(zhì)緊密嵌合，無法將菌絲體從栽培基質(zhì)上分離，造成了 RNA提 取困難、質(zhì)量差，影響擴增。食用菌營養(yǎng)生長階段RNA提取方法的缺失，導(dǎo)致整個食用菌生 長發(fā)育過程中分子機制數(shù)據(jù)鏈條的不完整，影響了研究的深入開展。因此建立高效、可靠的 食用菌菌絲體營養(yǎng)生長階段RNA提取方法就顯得尤為重要。
[0005] 目前，從液體培養(yǎng)基中的菌絲體、PDA培養(yǎng)基表面的菌絲體或者食用菌 的子實體中提取RNA的方法已有很多報道（Castanera R, P6rez G, Omarini A, et al. Transcriptional and enzymatic profiling of Pleurotus ostreatus laccase genes in submerged and solid ~state fermentation cultures[J]. Applied and environmental microbiology, 2012,78(11):4037 ~4045.，Abdelazim A M，Afifil&2M. Oyster mushroom(Pleurotus ostreatus) strain 238ameliorates the oxidative stress in STZ ~induced diabetic mice [J]· Life Science Journal，2013, 10(3)·，稅2S 容，鄭曉 冰，林俊芳，等.簡便高質(zhì)量的食用茵總RNA提取方法[J].食用菌學(xué)報，2008, 15(1) :32~ 41.)。但是有關(guān)菌絲體營養(yǎng)生長階段，菌絲體和栽培基質(zhì)緊密混合狀態(tài)下提取RNA的方法 還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種可用于食用菌菌絲體營養(yǎng)生長階段RNA提取的方法。該 方法可以有效去除培養(yǎng)基質(zhì)對RNA提取過程的干擾，具有RNA提取效率高、純度高、不含PCR 酶抑制劑等優(yōu)點。
[0007] 術(shù)語說明：
[0008] rpm :每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)，（revolutions per minute 轉(zhuǎn)數(shù) / 分）
[0009] 技術(shù)方案如下：
[0010] -種用于食用菌菌絲體營養(yǎng)生長階段RNA提取的方法，包括前處理階段和提取階 段，其特征在于，前處理階段包括下列步驟：
[0011] 1)取一份布滿菌絲體的培養(yǎng)基，粗研，置一潔凈容器中；
[0012] 2)加入適量的緩沖液I，至淹沒過布滿菌絲體的培養(yǎng)基，放置于恒溫搖床，保持溫 度35~40°C，搖床轉(zhuǎn)速100~150rpm搖動2~3h ;
[0013] 3)取步驟2)的溶液，3000~4000rpm低速離心10~15min ;溶液分成沉淀和上 清液，收集上清液；
[0014] 4)步驟3)中剩余的沉淀，加入緩沖液II洗滌，3000~4000rpm低速離心10~ 15min，洗滌過程重復(fù)2~5次，取每次洗滌后的上清液合并；
[0015] 5)將步驟3)和步驟4)離心的上清液集中到一起，在轉(zhuǎn)速10000~12000rpm，4°C 離心10~15min，棄上清液，收集沉淀。
[0016] 步驟2)中緩沖液I的加入量優(yōu)選為緩沖液I與培養(yǎng)基的體積范圍為比 (1.5 : 1)~（4.0 : 1)，更優(yōu)選的為3.0 : 1。加入緩沖液I的量過多會造成緩沖液I的 浪費，并不會影響提取效果；加入緩沖液I的量過少會造成菌絲體溶解不完全，進而菌絲體 中DNA釋放不完全，影響DNA提取的濃度和效率。步驟2)的目的是要將附著于培養(yǎng)基的菌 絲體細胞結(jié)構(gòu)溶解，使其中的DNA可以充分釋放出來；在此目的下，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本 發(fā)明的提示，對緩沖液I的加入量的任何調(diào)整，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。緩沖液I與培養(yǎng)基 的體積比為 I. 5 :1、1· 8 :1、2 :1、2· 2 :1、2· 4 :1、2· 6 :1、2· 8 :1、3 :1、3· 5 :1、4 :1 或者上述比 例的任意組合。
[0017] 步驟4)中緩沖液II的加入量與培養(yǎng)基的體積比為（1 :3)~（1. 5 :1)，只是要盡 量把附著于培養(yǎng)基的菌絲體中的DNA涮洗出來。步驟4)的目的是要盡量將已經(jīng)溶解出的 DNA涮洗出來，增加提取效率，保證提取的DNA濃度。緩沖液II的加入量優(yōu)選為1 :3、1 :2、 I :1、1. 5 :1或者上述加入量的任意組合的范圍區(qū)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的提示， 對緩沖液II的加入量的任何調(diào)整，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0018] 本發(fā)明所述的用于食用菌菌絲體營養(yǎng)生長階段RNA提取的方法，提取階段可以采 用現(xiàn)有技術(shù)，也可以采用下述的優(yōu)選條件。
[0019] 優(yōu)選的，用于食用菌菌絲體營養(yǎng)生長階段RNA提取的方法，其特征在于，提取階段 包括下列步驟：
[0020] 1)加入TRIzol試劑，混勻；
[0021] 2) 10000 ~15000r/min，2 ~8Γ，離心 5 ~20min ;
[0022] 3)取上清，加入酸和氯仿混合液，搖勾4~lOmin，靜置4~IOmin ;
[0023] 4) 10000 ~15000r/min，2 ~8°C，離心 5 ~20min ;
[0024] 5)取上清液，加入異丙醇，搖勻2~5min，放置~20°C冰箱中，靜置20~60min ;
[0025] 6) 10000 ~15000r/min，2 ~8Γ，離心 5 ~20min ;
[0026] 7)舍去上清液，留沉淀，加入乙醇沖洗；
[0027] 8) 10000 ~15000r/min，2 ~8Γ，離心 5 ~20min ;
[0028] 9)棄上清液，將其放入超凈工作臺，風干5~30min ;
[0029] 10)加入貯存液I，30~40°C作用10~20min，進一步采用RNA純化試劑盒純化 RNA ；
[0030] 11)-40~-20°C冰箱中保存。
[0031] 優(yōu)選的，步驟1)中，加入0· 1~2ml TRIzol試劑；更優(yōu)選的，加入1ml TRIzol試 劑。
[0032] 優(yōu)選的，步驟2)中，11000~13000r/min，3~5°C，離心6~15min ;更優(yōu)選的， UOOOr/mir^fC，離心 lOmin。
[0033] 優(yōu)選的，步驟3)中，取600 μ 1上清，加入500~800 μ 1酚和氯仿混合液，搖勻4~ 8min，靜置4~8min ;酚：氯仿體積比20~30 : 20~28 ;優(yōu)選的，加入600 μ 1酚和氯仿 混合液，酚：氯仿體積比25 : 24 ;
[0034] 優(yōu)選的，步驟4)中，11000~13000r/min, 3~5°C，離心6~15min ;更優(yōu)選的， UOOOr/mir^fC，離心 IOmin ;
[0035] 優(yōu)選的，步驟5)中，取600 μ 1上清液，加入500~800 μ 1異丙醇，搖勻2~4min， 放置-20°C冰箱中，靜置20~40min ;更優(yōu)選的，取600 μ 1上清液，加入600 μ 1異丙醇，搖 勻3min，放置-20°C冰箱中，靜置30min ;
[0036] 優(yōu)選的，步驟6)中，11000~13000r/min, 2~5°C，離心6~15min ;更優(yōu)選的， UOOOr/mir^fC，離心 IOmin ;
[0037] 優(yōu)選的，步驟7)中，舍去上清液，留沉淀，加入75%的乙醇沖洗；更優(yōu)選的，75%的 乙醇加入量為〇. 1~2ml ;更優(yōu)選的，75 %的乙醇加入量為lml。
[0038] 優(yōu)選的，步驟8)中，11000~13000r/min, 2~5°C，離心6~15min ;更優(yōu)選的， UOOOr/mir^fC，離心 IOmin ;
[0039] 優(yōu)選的，步驟9)中，棄上清液，將其放入超凈工作臺，風干10~20min ;更優(yōu)選的， 風干15min ;
[0040] 優(yōu)選的，步驟10)中，加入30~50 μ 1貯存液1，35~40°C作用12~18min，更優(yōu) 選的，加入40μ1貯存液I，37°C作用15min。
[0041] 優(yōu)選的，步驟11)中，-30~-20°C冰箱中保存；更優(yōu)選的，-20°C冰箱中保存。
[0042] 前處理階段緩沖液I :20mg/mL溶菌酶500 μ L+20mg/mL蛋白酶K 200 μ L+0. 02~ 0. lmmol/L pH 5. 5~6. 5PBS緩沖液配制成1000 ml溶液；溶菌酶為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水 解酶，蛋白酶K為是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶。
[0043] 前處理階段緩沖液 II EDTA+10% SDS lOml+0.0 2 ~0· Immol ρΗ5· 5 ~ 6. 5PBS緩沖液配制成100mL溶液；EDTA為乙二胺四乙酸；SDS為十二烷基磺酸鈉；
[0044] 提取 RNA 貯存液 I :1. 2mL DEPC 處理水 +lmmol BSA+DNase I(RNase free) 30U+RNase抑制劑40U配制成100mL溶液；DEPC處理水：無菌蒸餾水中加入0. 1 % (v/ V)焦碳酸二乙酯（DEPC)，室溫攪拌4小時以上，121度高壓滅菌20分鐘，冷卻備用；DNase I (RNase free):去除了核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA 產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶，作用是除去RNA中的基因 組DNA ;RNase抑制劑：核糖核酸酶抑制劑，作用是保存RNA的穩(wěn)定，不被降解。
[0045] TRIZOL是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA。其含 有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶。TRIZOL試劑可以 購買也可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的文獻自己制備。
[0046] 本發(fā)明中，如果沒有特殊說明，溶劑均為水。本發(fā)明未詳述的部分，均可采用現(xiàn)有 技術(shù)。
[0047] 瓊脂糖凝膠電泳測定完整性：
[0048] 將2. 5 μ 1所提RNA與上樣緩沖液混勻后進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，120V 20min后上凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。若條帶清晰、明亮，說明RNA完整性較好、無降解，所 提總RNA可以用于逆轉(zhuǎn)錄。
[0049] 本發(fā)明的有益效果在于：
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