多功能多肽/脂質(zhì)體/透明質(zhì)酸組裝的類病毒核酸載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種藥物技術(shù)領(lǐng)域的藥物輸送技術(shù)，特別是一種可用于核酸 (DNA、siRNA、micr 〇RNA以及shRNA等）體內(nèi)系統(tǒng)輸送的非病毒載體體系的構(gòu)建及制備技術(shù)， 具體涉及一種多功能多肽/脂質(zhì)體/透明質(zhì)酸組裝的類病毒核酸載體。
【背景技術(shù)】
[0002] 在基因治療中，核酸藥物從概念走向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵性瓶頸是其體內(nèi)輸送系統(tǒng)的 研發(fā)。其中非病毒載體以聚陽離子和陽離子脂質(zhì)體為主，它們相比病毒載體而言除了載 體本身沒有生物安全隱患之外，還具有成本低，基因擔(dān)載密度和擔(dān)載分子量大、制備簡單， 便于化學(xué)修飾等優(yōu)勢，也存在著化學(xué)毒性大、體內(nèi)循環(huán)周期短（不利于靶向）的缺點(diǎn)。在 科學(xué)家為了有效解決合成載體自身的缺點(diǎn)，發(fā)揮其優(yōu)勢，從而達(dá)到體內(nèi)安全高效輸送核酸 的過程中，上述兩種載體近二十年來已經(jīng)發(fā)展成為以下兩類新型載體，其一是通過對(duì)聚陽 離子的不斷改進(jìn)的生物大分子輸送體系[Venkataraman，S等，聚陽離子聚（甲基丙烯酸 二甲基氨基乙酯）的分子量與PEG化程度在基因輸送中的影響，生物材料，2011，32,（9)， 2369-78. ]，[Zhang，W等，PEG化透明質(zhì)酸包裹的聚陽離子/DNA復(fù)合物的基因輸送效率和 生物相容性，生物材料，2013, 34,（27),6495-503.];其二是通過對(duì)陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行多功 能修飾的脂質(zhì)輸送體系[Maitani，Y等人，從傳統(tǒng)到隱形脂質(zhì)體：癌癥化療的新前沿，腫瘤， 2003,89,（3),237-49.]，前者主要通過對(duì)聚陽離子接枝聚乙二醇（PEG)和靶向基團(tuán)，來達(dá) 到體內(nèi)長效循環(huán)并靶向特定細(xì)胞的目的，這種方法除了聚陽離子本身的毒性外，還存在高 分子化學(xué)接枝率難以控制，PEG的物理共混和接枝后的嵌段共聚物難以分離等問題[Lai， T等人，生物響應(yīng)的pH值敏感多聚乙二醇嵌段共聚物作為DNA載體，藥學(xué)研究，2010, 27， (11),2260-73.]。近年來顧忠偉等人利用透明質(zhì)酸和聚乙烯亞胺（PEI)包裹輸送核酸，希 望達(dá)到體內(nèi)長效循環(huán)，靶向特定腫瘤細(xì)胞，并能夠突破細(xì)胞內(nèi)壁壘順利到達(dá)治療位點(diǎn)，但聚 陽離子并不能完全封閉包裹的核酸，容易被表面覆蓋的透明質(zhì)酸置換出來。另一方面，單 純依靠對(duì)陽離子脂質(zhì)體本身的不斷修飾（如接枝PEG、靶向基團(tuán)等方法）同樣存在載體 組裝不穩(wěn)定，很難突破體內(nèi)的生物學(xué)壁壘，安全有效地將核酸藥物輸送到特定的治療位點(diǎn) 等問題[[Maitani，Y等人，從傳統(tǒng)到隱形脂質(zhì)體：癌癥化療的新前沿，腫瘤，2003,89,（3)， 237-49.]。所以經(jīng)過不斷發(fā)展，出現(xiàn)了利用聚陽離子、脂質(zhì)體相結(jié)合的方法構(gòu)建核酸輸送 納米顆粒（lipopolyplexes) [Posadas, I等人，利用非病毒載體輸送siRNA到中樞神經(jīng)系 統(tǒng)，納米醫(yī)學(xué)，2010, 5，（8),1219-36.]，即首先使聚陽離子與核酸形成復(fù)合物（polyplex), 然后通過靜電作用將polyplex包裹在帶有相反電荷的脂質(zhì)體中。從而形成了較前二者更 高活性與降低了毒性的新生代非病毒載體。這方面的文獻(xiàn)雖然不算少，但其主要特點(diǎn)是通 過變換不同的聚陽離子或利用其它的類似聚陽離子功能的生物材料來包裹核酸形成二元 復(fù)合物，再與陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行進(jìn)一步自組裝構(gòu)建lipopolyplexes.目前按不同的包裹核 酸的材料分為三類：首先是Huang. L教授等人利用魚精蛋白或磷酸鈣鹽與陽離子脂質(zhì)體包 裹核酸自組裝成的三元復(fù)合物[Zhang，J等人，輸送siRNA治療乳腺癌的非病毒載體，控 釋雜志，2014];其次是倫敦大學(xué)學(xué)院Hart，S L教授為代表的利用陽離子脂質(zhì)體和含有 靶向序列的陽離子多肽與核酸組裝成的多功能靶向受體的納米顆粒（RTNs);以及其它利 用天然的或合成的陽離子聚合物、陽離子脂質(zhì)體，以及核酸組裝的三元復(fù)合物[Hart，S.L， 多功能納米復(fù)合物的基因輸送和基因治療，細(xì)胞生物學(xué)和毒理學(xué)，2010, 26,（1),69-81]。 Lipopolyplexes的優(yōu)點(diǎn)是利用各組成成分的協(xié)同效應(yīng)，將各組成成分功能專一化，即利用 聚陽離子來包裹核酸，依靠脂質(zhì)體的融膜作用來突破細(xì)胞膜與內(nèi)涵體膜，從而提高了載體 對(duì)核酸的的包裹與細(xì)胞內(nèi)輸送能力。其缺點(diǎn)是除了包括聚陽離子的高毒性外，該類載體仍 然通過將外圍的陽離子脂質(zhì)體化學(xué)接枝聚乙二醇（PEG)和靶向基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)體內(nèi)長效循環(huán) 與靶向特定組織細(xì)胞表面的受體，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這類載體體內(nèi)效果不太理想。其中 Hart，S. L教授制備的多功能受體靶向納米顆粒雖然利用多肽與脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)了載體體內(nèi) 生物相容性與大大減小的毒性，并且利用多肽進(jìn)行包裹核酸的同時(shí)進(jìn)行靶向細(xì)胞表面的受 體，但其在屏蔽電荷方面沒有新的優(yōu)勢，仍然需要通過PEG化的脂質(zhì)體來參與，因?yàn)镻EG的 多少直接決定載體在體內(nèi)能否長效循環(huán)，這就使問題變得復(fù)雜化。目前還沒有能夠突破該 三元復(fù)合體共有缺點(diǎn)的新型載體。本發(fā)明就是在Iipolyplexes的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一類發(fā)揮 其優(yōu)點(diǎn)并突破其弊端的藥用載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有核酸體內(nèi)輸送技術(shù)中的不足，提供一種可以緊密 包裹核酸、表面帶負(fù)電荷以便體內(nèi)長效循環(huán)、靶向特定細(xì)胞并有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多功能 多肽/脂質(zhì)體/透明質(zhì)酸組裝的類病毒核酸載體；更具體來說，是一種多功能陽離子 多肽/脂質(zhì)體/透明質(zhì)酸協(xié)同組裝的靶向特定細(xì)胞表面的高效安全的類病毒核酸載體 (Q-complexeses) 〇
[0004] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 第一方面，本發(fā)明涉及一種多功能多肽/脂質(zhì)體/透明質(zhì)酸組裝的類病毒核酸載 體，所述類病毒核酸載體是表面帶負(fù)電荷的具有雙靶向基團(tuán)的納米級(jí)核酸載體；所述類病 毒核酸載體的內(nèi)核是由多功能多肽與陽離子脂質(zhì)體共混，加入核酸進(jìn)行自組裝形成的（表 面帶正電荷的）納米顆粒；所述類病毒核酸載體的外殼是聚陰離子，所述聚陰離子通過靜 電作用包裹在所述納米顆粒的表面。
[0006] 優(yōu)選的，所述聚陰離子選自透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸鈉、羧甲基殼聚糖中的一種或幾 種。
[0007] 優(yōu)選的，所述陽離子脂質(zhì)體是由陽離子脂質(zhì)與中性脂質(zhì)或膽固醇形成的脂質(zhì)體。
[0008] 優(yōu)選的，所述陽離子脂質(zhì)體具有陽離子雙層磷脂膜。
[0009] 優(yōu)選的，所述多功能多肽是由陽離子多肽序列與細(xì)胞穿透肽序列直接連接而成。
[0010] 優(yōu)選的，所述多功能多肽包含SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
[0011] 優(yōu)選的，所述核酸選自 DNA、siRNA、microRNA 或 shRNA。
[0012] 第二方面，本發(fā)明還涉及一種前述的多功能多肽/脂質(zhì)體/透明質(zhì)酸組裝的類病 毒核酸載體的制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0013] A、通過薄膜分散法制備陽離子脂質(zhì)體：陽離子脂質(zhì)與中性脂質(zhì)或膽固醇水合作用 制得陽離子脂質(zhì)體；
[0014] B、納米載體的制備：將所述陽離子脂質(zhì)體稀釋到到5~10 μ g/mL，與20~40 μ g/ mL的多功能多肽混合后，加入到核酸中，常溫孵育，制得表面帶正電荷的納米顆粒；
[0015] C、將所述表面帶正電荷的納米顆粒與聚陰離子溶液混合均勻，即得所述多功能多 肽/脂質(zhì)體/透明質(zhì)酸組裝的類病毒核酸載體。
[0016] 優(yōu)選的，所述陽離子脂質(zhì)體、多功能多肽、核酸的質(zhì)量比為（0.5~2) : (2~ 6) : 1;所述聚陰離子、核酸的質(zhì)量比為10 : 1~40 : 1。更優(yōu)選，所述陽離子脂質(zhì)體、多功 能多肽、核酸的質(zhì)量比為（0.75~I) : 4 : 1;所述聚陰離子、核酸的質(zhì)量比為14. 2 : 1~ 33.6 : 1〇
[0017] 第三方面，本發(fā)明還涉及一種前述的多功能多肽/脂質(zhì)體/透明質(zhì)酸組裝的類病 毒核酸載體在作為體內(nèi)系統(tǒng)輸送核酸體系中的用途。
[0018] 本發(fā)明通過核酸、包含陽離子多肽-b_細(xì)胞穿透胎的兩嵌段序列多肽（如圖1)、陽 離子脂質(zhì)體，以及透明質(zhì)酸通過協(xié)同效應(yīng)自組裝構(gòu)建的納米載體的組成與功能如下：
[0019] (1)利