通過高碳源發(fā)酵獲得胞外水溶性紅曲黃色素的方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及紅曲霉的發(fā)酵方法，特別涉及一種通過高碳源發(fā)酵獲得胞外水溶性紅曲黃色素的方法及應用。
【背景技術】
[0002]紅曲色素是一種天然色素，由紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)，在中國、韓國和日本一直被作為天然的食用色素廣泛用于飲料、醬、食用油、面包、糕點等領域，已有上千年歷史。目前商品用紅曲色素一般為混合色素，主要分為紅、橙、黃三大類。已被證實鑒定的紅曲色素有50多種，其中包含常見的六種胞內(nèi)色素:2種紅色素(Rubropunctamine、Monascorubramine)，2種澄色素(Rubropunctatine、Monascorubrine)和 2 種黃色素(Ankaflavine, Monascin)。近年來，有研究報道黃色素monascin和黃色素ankaf Iavin是降脂的有效成分，能顯著降低血清TC、TG、低密度脂蛋白和膽固醇的水平；水溶性黃色素著色能力強，熱穩(wěn)定性、耐氧化劑和耐還原劑的性能好，故紅曲黃色素的開發(fā)研究具有廣闊的前景和重大的經(jīng)濟效益。
[0003]紅曲霉液態(tài)發(fā)酵的紅曲色素主要是胞內(nèi)色素，這些色素易溶于乙醇、丙酮等極性較大的有機溶液，都是非水溶性的色素，在食品應用方面受到一定的限制。同時液態(tài)發(fā)酵面臨兩個瓶頸問題:一是發(fā)酵過程中菌體胞內(nèi)產(chǎn)物的高濃度會導致產(chǎn)物的負反饋抑制；二是發(fā)酵結(jié)束后胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物分離提取困難，產(chǎn)物純化流程復雜，成本較高。因此，局部改變胞內(nèi)色素分子結(jié)構(gòu)及其發(fā)色性能，制備一系列衍生物，實現(xiàn)紅曲色素溶解性能的改善，或者采用一種發(fā)酵技術實現(xiàn)胞外紅曲色素的高產(chǎn)量輸出，具有很好的應用前景及重大的市場開發(fā)價值。
[0004]現(xiàn)階段，紅曲紅色素已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但紅曲黃色素仍處于開發(fā)研究階段，并且色階及色調(diào)值偏低。現(xiàn)有文獻檢索發(fā)現(xiàn):紅曲霉常規(guī)液態(tài)發(fā)酵，胞外黃色素產(chǎn)量一般在10AU/mL 左右。Zhiqiang Hu 等(Appl Microb1l B1technol, 2012,94:81-89)中介紹，米用非離子表面活性劑進行萃取發(fā)酵紅曲色素，實現(xiàn)了將胞內(nèi)色素萃取到胞外表面活性劑膠束溶液，胞外黃色素色階可達到50AU/mL，但其色調(diào)僅為2左右，即仍有較高含量的紅色素和橙色素。采用萃取發(fā)酵使得胞外黃色素產(chǎn)量得到了一定的提高，但從表面活性劑中提取色素的食品安全性、回收技術成本、萃取到胞外黃色素的水溶性等方面仍需要深入的探索和研究。目前對直接發(fā)酵大量制備胞外水溶性紅曲色素，并大幅度降低紅曲紅、橙色素的比例，得到高純度黃色素的研究還沒有相關的市場報道。
[0005]現(xiàn)有的發(fā)酵技術，所得的紅曲色素基本上都是紅曲紅色素、橙色素以及黃色素的混合物。因此，亟需一種能高效獲得紅曲黃色素的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種通過高碳源發(fā)酵獲得胞外水溶性紅曲黃色素的方法。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供所述通過高碳源發(fā)酵獲得胞外水溶性紅曲黃色素的方法的應用。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):一種通過高碳源發(fā)酵獲得胞外水溶性紅曲黃色素的方法，包括如下步驟:
[0009](I)將紅曲霉菌種接種于基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行好氧發(fā)酵，使得紅曲霉菌種處于對數(shù)生長期或穩(wěn)定期；
[0010](2)接著補加碳源，該碳源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為至少60g/L，繼續(xù)好氧發(fā)酵；
[0011](3)將發(fā)酵好的發(fā)酵液進行固液分離，取液體，得到胞外水溶性紅曲黃色素。
[0012]步驟(I)中所述的基本發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下??每10mL基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，含葡萄糖 5g、(NH4)2SO40.5g、KH2PO40.5g、KCl 0.05g、MgSO4.7Η200.05g、FeSO4.7H20 1.0mg、ZnSO4.7H20 1.0mg、MnSO4.H2O 3.0mg，用蒸餾水定容至 100ml，pH 自然。
[0013]步驟(I)中所述的紅曲霉菌種優(yōu)選為紅曲霉菌(Monascus anka)GIM 3.592或于2015年7月2日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心、保藏編號為CGMCC N0.10910的紅色紅曲霉(Monascus ruber)WQ150
[0014]步驟⑴中所述的紅曲霉菌種在接種于基本發(fā)酵培養(yǎng)基時，優(yōu)選為將紅曲霉菌種進行活化、擴大培養(yǎng)后再接種入基本發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0015]所述的活化為常規(guī)的手段，如將紅曲霉菌種劃線于平板中進行培養(yǎng)。
[0016]所述的擴大培養(yǎng)為常規(guī)的手段，具體操作如下:從活化好的紅曲霉菌種從平板上接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖，每50mL種子培養(yǎng)基接種3?5個培養(yǎng)4?7天的單菌落、27?34°C、150?250rpm培養(yǎng)24?32h，使種子培養(yǎng)基有成熟的孢子，得到種子液。
[0017]所述的擴大培養(yǎng)的步驟更優(yōu)選如下:將活化好的紅曲霉菌種從平板上接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖，每50mL培養(yǎng)基接種3?5個培養(yǎng)6天的單菌落、30°C、180rpm培養(yǎng)28h，使種子培養(yǎng)基有成熟的孢子，得到種子液。
[0018]所述的種子培養(yǎng)基的組成如下??每10mL種子培養(yǎng)基中含葡萄糖2g，酵母浸粉0.3g，魚粉蛋白胨 1.0g,KCl 0.05g,KH2PO40.4g,FeSO4.7Η20 1.0mg，用蒸餾水定容至 10mL,pH自然。
[0019]步驟(I)中所述的好氧發(fā)酵的時間如下:當紅曲霉菌種的接種量為體積百分比5?10%時，好氧發(fā)酵的時間為2?4天；優(yōu)選為接種量為體積百分比8%時，好氧發(fā)酵的時間為3天。
[0020]步驟(I)、⑵中所述的好氧發(fā)酵的條件為:27?34°C、150?250rpm振蕩培養(yǎng)；更優(yōu)選為30 °C、180rpm振蕩培養(yǎng)。
[0021]步驟(2)中所述的碳源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為60?300g/L。
[0022]步驟⑵中所述的碳源優(yōu)選為葡萄糖、蔗糖和甘油中的至少一種。
[0023]步驟⑵中所述的好氧發(fā)酵時間為6?16天。
[0024]步驟(3)中所述的固液分離的方法優(yōu)選為離心。
[0025]所述通過高碳源發(fā)酵獲得胞外水溶性紅曲黃色素的方法在制備紅曲黃色素中的應用。
[0026]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果:本發(fā)明通過采用高碳源直接發(fā)酵法方法，優(yōu)化紅曲霉菌的代謝，得到高色價以及高色調(diào)的胞外水溶性紅曲黃色素，實現(xiàn)了天然水溶性紅曲黃色素的生產(chǎn)。本發(fā)明可取代目前轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)紅曲黃色素工藝，消除化學轉(zhuǎn)化步驟的不良影響，得到純天然紅曲黃色素產(chǎn)品，不含人工改造結(jié)構(gòu)成分，符合食品安全質(zhì)量要求，應用前景廣闊。
【附圖說明】
[0027]圖1是高碳源濃度(補加300g/L)下紅曲發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵胞外色素的波長掃描圖。
[0028]圖2是高碳源濃度(補加60g/L葡萄糖)下紅曲發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵胞外色素的波長掃描圖。
[0029]圖3是高碳源發(fā)酵紅曲菌Monascus anka GIM 3.592胞外色素特征波長色價柱形圖。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0031]實施例1
[0032](I)種子液的制備:將劃線于平板上的紅色紅曲霉(Monascus ruber) WQ15 (保藏編號為CGMCC N0.10910)種子接種于滅菌的種子培養(yǎng)基(葡萄糖lg，酵母浸粉0.15g，魚粉蛋白胨 0.5g，KCl 0.025g，KH2PO40.2g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.5mg，用蒸餾水定容至 50mL，pH 自然)中進行培養(yǎng)增殖，50ml種子培養(yǎng)基接種5個培養(yǎng)6天的單菌落，300C、180rpm培養(yǎng)30h，使種子培養(yǎng)基有成熟的孢子，得到種子液。
[0033](2)高碳源發(fā)酵:將步驟⑴得到的種子液按8%接種量(V/V)接種到基本發(fā)酵培養(yǎng)液(葡萄糖 1.25g，(NH4)2SO40.125g，KH2PO40.125g，MgSO4.7Η200.0125g，KCl 0.0125g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.25mg，ZnSO4.7H20 0.25mg，MnSO4.H2O0.75mg，用蒸餾水定容至 25mL，pH 自然)中，30°C、180rpm發(fā)酵培養(yǎng)3天；然后補加300g/L的葡萄糖(即補加了 7.5g葡萄糖)，發(fā)酵培養(yǎng)15天，離心、抽濾得上清液(即胞外紅曲色素)，檢測胞外的色素濃度。
[0034](3)常規(guī)發(fā)酵:將步驟(I)得到的種子液按8%接種量(V/V)接種到基本發(fā)酵培養(yǎng)液(葡萄糖 1.25g，(NH4)2SO40.125g，KH2PO40.125g，MgSO4.7Η200.0125g，K