一種卵黃高磷蛋白磷酸肽富集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種卵黃高磷蛋白磷酸肽富集方法，屬于提取純化分離領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋黃蛋白粉是蛋黃卵磷脂工業(yè)化生產(chǎn)的副產(chǎn)物，越來(lái)越來(lái)的學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了綜合 研究并取得了一些進(jìn)展。卵黃高磷蛋白（Phosvitin，PV)是脫脂蛋黃蛋白粉中的主要含磷 蛋白，一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有217個(gè)氨基酸殘基，其中124個(gè)是絲氨酸殘基，約占總氨基酸殘基含 量的56%。已有眾多研究表明，卵黃高磷蛋白可與Ca 2+，Mg2+，Mn2+，Co2+，Sr2+，F(xiàn)e 2+，F(xiàn)e3+等 結(jié)合。由于卵黃高磷蛋白與金屬離子結(jié)合牢固，不易被水解，使得其生物學(xué)效價(jià)較低，不 利于營(yíng)養(yǎng)吸收?，F(xiàn)已證實(shí)，能與鈣形成可溶性絡(luò)合物的主要功能團(tuán)是磷酸酰絲氨酸，所以 將磷酸酰絲氨酸殘基含量高的卵黃高磷蛋白進(jìn)行水解，其水解產(chǎn)物卵黃高磷蛋白磷酸肽 (Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)可作為很好的鈣吸收促進(jìn)劑，不僅能增加 鈣在小腸內(nèi) 的吸收及其在體內(nèi)的蓄積，而且卵黃高磷蛋白磷酸肽誘導(dǎo)的鈣代謝無(wú)需維生素 D的參與， 且能促進(jìn)鐵、鋅等離子的吸收。
[0003]目前關(guān)于卵黃高磷蛋白磷酸肽研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室水平。常規(guī)的PPPs制備方法是 先從蛋黃粉中提取出卵黃高磷蛋白PV，然后對(duì)PV進(jìn)行處理，純化得到PPPs。也有報(bào)道，是 先對(duì)蛋黃粉進(jìn)行脫脂，然后對(duì)脫脂后的蛋黃粉進(jìn)行處理得到粗多肽，再純化得到PPPs。采用 的純化方法為乙醇鈣沉淀法、膜分離法和離子交換樹脂等方法。乙醇鈣沉淀法雖然方法簡(jiǎn) 單，但是有機(jī)試劑用量大，對(duì)環(huán)境有一定的污染；膜分離法膜污染情況嚴(yán)重，需要進(jìn)行清洗 維護(hù)；離子交換樹脂法需要使用前和再生時(shí)進(jìn)行處理，操作復(fù)雜。也有報(bào)道是磁納米顆粒富 集法進(jìn)行純化的，但是磁納米顆粒不僅穩(wěn)定性差（重復(fù)使用三次時(shí)已不能發(fā)生吸附），而且 洗脫過(guò)程中使用的咪唑溶劑不符合食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服目前卵黃高磷蛋白磷酸肽（Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)，純化過(guò) 程中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明一種卵黃高磷蛋白磷酸肽富集方法，直接以利用蛋黃卵磷脂 生產(chǎn)的副產(chǎn)物為原料，省去脫脂步驟，然后進(jìn)行脫磷、酶解，制備粗多肽。本發(fā)明采用介孔/ 大孔 TiO2 (macro-mesoporous titanium dioxide，MMTD)為富集材料，直接將 PPPs 特異性 吸附出來(lái)，然后根據(jù)1102的性質(zhì)進(jìn)行洗脫（堿性條件下PPPs與TiO 2發(fā)生離子排斥反應(yīng)）， 操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間，不僅提高了吸附效率，也大大減少了生產(chǎn)成本。
[0005] 本發(fā)明提供了一種卵黃高磷蛋白磷酸肽富集方法，所述方法是先將蛋黃蛋白粉進(jìn) 行部分脫磷處理，然后使用胰蛋白酶對(duì)部分脫磷后的蛋黃蛋白粉進(jìn)行酶解，得到粗多肽，再 采用介孔/大孔TiO 2M料對(duì)粗多肽進(jìn)行吸附，洗脫，即得到卵黃高磷蛋白磷酸肽。
[0006] 所述蛋黃蛋白粉，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是蛋黃卵磷脂生產(chǎn)中的副產(chǎn)物。
[0007] 所述吸附、洗脫，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將粗多肽配制成濃度為6mg/ mL-22mg/mL的溶液，按每30mL粗多肽溶液加入Ig介孔/大孔1102材料，在pH 1. 0-6. 0下 震蕩吸附5-60min，然后過(guò)濾，洗滌濾渣以去除表面吸附的雜質(zhì)，然后用堿性溶液將濾渣表 面富集的卵黃高磷蛋白磷酸肽進(jìn)行洗脫。
[0008] 所述粗多肽溶液，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，粗多肽濃度為12mg/mL-20mg/mL。
[0009] 所述pH，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，pH 2. 5-4。
[0010] 所述吸附，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，吸附時(shí)間為5-30min，優(yōu)選5-20min。
[0011] 所述吸附，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在15-25°C，150-220rpm進(jìn)行。
[0012] 所述洗脫，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是使用0. 05-0. 20m〇L/L的NaOH溶液。
[0013] 所述吸附、洗脫，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，條件是：pH為3.0,粗多肽濃度為 17mg/mL，吸附時(shí)間為20min。
[0014] 所述部分脫磷處理，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是采用堿法脫磷。
[0015] 所述部分脫磷處理，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將蛋黃蛋白粉置于堿性溶液 中，攪拌處理，然后超濾除去磷酸根離子。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，脫磷率為48-64%。
[0016] 所述部分脫磷處理，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是：將蛋黃蛋白粉置于 0. 1-0. 2mol/L的NaOH溶液中，37°C條件下攪拌3h進(jìn)行堿法脫磷處理，將處理后的溶液進(jìn)行 超濾除去磷酸根離子（超濾膜為3000K，回流口壓力為5~IOpsi，進(jìn)口壓力為20~30psi)。
[0017] 所述酶解，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將經(jīng)脫磷處理的蛋黃蛋白粉（脫磷率 為48-64% )和水加入酶解反應(yīng)器中，攪拌均勻，在37-50°C，pH 7. 0-9. 0條件下，加入胰蛋 白酶進(jìn)行酶解；酶解結(jié)束后進(jìn)行滅酶處理，得到含有PPPs的蛋黃蛋白水解多肽，即粗多肽； 所述底物蛋黃蛋白粉的濃度為〇. 5-2. 0%，酶：底物=1:20-1:200。在本發(fā)明的一種實(shí)施方 式，水解度為12%以上。
[0018] 所述酶解，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，時(shí)間為0. 4-4h。優(yōu)選50-100min。
[0019] 所述酶解，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在50°C、pH 8的條件下進(jìn)行，底物蛋黃 蛋白粉的濃度為1% (m/v)，酶與底物質(zhì)量比為5:100。滅酶處理后，先調(diào)節(jié)pH至中性，再 冷凍干燥得粗多肽。
[0020] 所述介孔/大孔TiO2，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是采用溶膠凝膠法得到的。
[0021] 所述介孔/大孔TiO2，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是按照以下步驟制備得到的： 檸檬酸溶于乙醇中，攪拌，然后加入氨水溶液，繼續(xù)攪拌，之后將鈦酸四正丁酯在攪拌狀態(tài) 下，逐滴加入上述溶液，攪拌，然后靜置；然后依次用水和無(wú)水乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行清洗，將洗滌 后的材料干燥，最后將上述材料置于馬弗爐中進(jìn)行煅燒；其中每〇. 3g的檸檬酸，加入ISmL 質(zhì)量濃度為25% -28%的氨水和5mL鈦酸四正丁酯。
[0022] 所述介孔/大孔TiO2，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是按照以下步驟制備得到的： 每〇. 3g的檸檬酸溶于乙醇中，攪拌30min，然后加入質(zhì)量濃度為25% -28%氨水溶液18mL， 繼續(xù)攪拌l〇min，之后將5mL鈦酸四正丁酯在攪拌狀態(tài)下，逐滴加入上述溶液，繼續(xù)攪拌lh， 然后靜置；然后依次用水和無(wú)水乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行清洗，將洗滌后的材料干燥，最后將上述材 料置于550°C煅燒4h。
[0023] 所述溶解檸檬酸的乙醇，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為40mL 95%無(wú)水乙醇。
[0024] 所述煅燒，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，煅燒條件為550°C，4h。
[0025] 本發(fā)明還要求保護(hù)按照上述方法得到的卵黃高磷蛋白磷酸肽，以及其在食品方面 的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明的有益效果：
[0027] (1)本發(fā)明提供的卵黃高磷蛋白磷酸肽的富集方法操作簡(jiǎn)單、分離純化周期較短， 適合工業(yè)化應(yīng)用；從吸附、清洗到洗脫整個(gè)過(guò)程在1~3小時(shí)內(nèi)完成；而常規(guī)乙醇沉淀法 時(shí)間為2-3個(gè)小時(shí)，膜分離法時(shí)間為4個(gè)小時(shí)，且步驟繁多，膜容易污染；（2)本發(fā)明方法 所得卵黃高磷蛋白磷酸肽產(chǎn)品的N/P為4. 3-5. 0,與目前報(bào)道方法得到的磷酸肽相比，純度 較高；（3)本發(fā)明方法還對(duì)現(xiàn)有的脫磷方法和酶解方法進(jìn)行了改進(jìn)，直接對(duì)蛋黃蛋白粉進(jìn) 行堿法脫磷，脫磷率可達(dá)64%，酶解的水解度為15.67% ;同時(shí)采用具有規(guī)則的孔道結(jié)構(gòu)與 較大的比表面積的介孔/大孔TiO2富集PPPs，吸附效率高，吸附量可達(dá)42-53mg/g(PPPs/ MMTD)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已有報(bào)道。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1 :介孔/大孔1102材料的掃描電鏡。
【具體實(shí)施方式】 [0029] 脫磷率：
[0030] 根據(jù)GB/T 5009. 87- 2003,通過(guò)分光光度計(jì)法對(duì)脫磷前后的EYP進(jìn)行磷含量的測(cè) 定。通過(guò)下述公式進(jìn)行脫磷率的計(jì)算：
[0032] p :EYP 的脫磷率（％ )
[0033] Cpl:脫磷前EYP中磷的含量（mg/g)
[0034] Cp2:脫磷后EYP中磷的含量（mg/g)
[0035]水解度（DH):
[0036] 根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中記錄所消耗的NaOH溶液的體積，按下述公式進(jìn)行計(jì)算：
[0038] DH :脫磷EYP的水解度（％ )
[0039] VNaffl:滴定過(guò)程中消耗的NaOH的體積（mL)
[0040] CNaffl:反應(yīng)使用的NaOH的摩爾濃度（m〇L/L)
[0041] MP :底物中蛋白質(zhì)的總量（g)
[0042] α :氨基酸解離度（50°C，pH = 8. 0 時(shí)，I/ a = L 13)
[0043] htot:每克蛋白質(zhì)中肽鍵的克當(dāng)量（8.38)
[0044] N/P ：
[0045] 計(jì)算方法如以下公式：
[0047] r :待測(cè)樣品中N和P的摩爾比
[0048] CN:待測(cè)樣品中N的含量（mg/g)
[0049] Cp:待測(cè)樣品中P的含量（mg/g)
[0050] 31 :P的相對(duì)分子質(zhì)量
[0051] 14 :N的相對(duì)分子質(zhì)量
[0052] 實(shí)施例1 :蛋黃蛋白粉部分脫磷方法
[0053] 將蛋黃蛋白粉置于0. 05-0. 2mol/L的不同濃度的NaOH溶液中，37°C條件下攪拌3h 進(jìn)行堿法脫磷處理，將處理后的溶液進(jìn)行超濾除去磷酸根離子（超濾膜為3000K，回流口壓 力為5~lOpsi，進(jìn)口壓力為20~30psi)，比較了不同濃度的NaOH溶液處理下蛋黃蛋白粉 的脫磷率。
[0054] 結(jié)果顯示 0· 05mol/LNa0H，脫磷率為 27%;0· Imol/LNaOH，脫磷率為 46%;0· 15mol/ L時(shí)，脫磷率為53% 2mol/L時(shí)，脫磷率為64%。
[0055] 實(shí)施例2 :部分脫磷的蛋黃蛋白粉的酶解
[0056] 對(duì)部分脫磷處理的蛋黃蛋白粉進(jìn)行酶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫磷率低，導(dǎo)致水解度低。但是 如果脫磷過(guò)度，得到的PPPs持鈣功能降低。所以選用脫磷率在46 % -64 %的脫磷后的蛋黃 蛋白粉進(jìn)行酶解。
[0057] 酶解過(guò)程如下：將脫磷蛋黃蛋白粉和去離子水加入酶解反應(yīng)器中（底物濃度為 1 % )，50°C水浴循環(huán)加熱，待溶液攪拌均勻后，調(diào)節(jié)pH至8. 0,將一定量的胰蛋白酶加入上 述溶液（酶：底物=5 :100)，反應(yīng)過(guò)程中用0. lmol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定，維持pH為8.0， 反應(yīng)時(shí)間4h。酶解結(jié)束后將上述反應(yīng)溶液置于90°C條件下，IOmin處理進(jìn)行滅酶處理，冷卻 后將酶解液PH調(diào)至7. 0。最后將酶解液進(jìn)行冷凍干燥得到含有PPPs的蛋黃蛋白水解多肽 (簡(jiǎn)稱粗多肽）。采用脫磷率在64%的蛋黃蛋白粉的酶解的水解度為15. 67%。而且在Ih 內(nèi)就可以得到14%以上的水解度。
[0058] 實(shí)施例3 :介孔/大孔1102材料的制備