一種結(jié)直腸癌早期診斷標記物及相關(guān)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種結(jié)直腸癌早期診斷標記物，特別是由血漿microRNA組成的結(jié)直 腸癌早期診斷標記物，以及由該結(jié)直腸癌早期診斷標記物構(gòu)建的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)報道，結(jié)直腸 癌是男性第三位和女性第二位常見的惡性腫瘤。2012年全球男性結(jié)直腸癌新發(fā)病例為 746000例，占所有惡性腫瘤10% ;女性結(jié)直腸癌新發(fā)病例為614000例，占所有惡性腫瘤 9. 2%。近年來在我國的發(fā)病率和死亡率不斷攀升，每年新增病例已超過17萬人，死亡近10 萬人，發(fā)病率位居我國惡性腫瘤第三，直追歐美國家。根據(jù)廣州市2013年9月公布的惡性 腫瘤發(fā)病及死亡率統(tǒng)計結(jié)果，男女結(jié)直腸癌發(fā)病率分別上升了 53. 31 %和39. 35%，發(fā)病率 位居第二位，死亡率位于所有惡性腫瘤中第三位。
[0003] 過去50年來盡管結(jié)直腸癌手術(shù)方式和輔助治療手段不斷發(fā)展，結(jié)直腸癌根治性 手術(shù)后生存率卻無太大變化，約50%患者術(shù)后因局部復發(fā)或轉(zhuǎn)移而最終死亡。預后不良的 主要原因之一是就診時絕大部分患者已屬中晚期，僅56%患者可行根治性切除。死因直接 與分期較晚有重要關(guān)聯(lián)。以國際抗癌聯(lián)盟（UICC)和美國腫瘤聯(lián)合會（AJCC)聯(lián)合制定的最 新??!分期系統(tǒng)為標準，根據(jù)現(xiàn)有的統(tǒng)計資料，I、Ila、Ilb、Ilia、Illb、IIIc和IV期結(jié)直 腸癌患者的5年生存率分別為93. 2%、84· 7%、72· 2%、83· 4%、64· 1%、44· 3%和8· 1%，可 見早期診治的重要性。
[0004] 結(jié)直腸癌大多經(jīng)歷了正常粘膜~腺瘤~腺癌的發(fā)展過程，即Nomal-Adenoma一 Adenocarcinoma(N. A. AC)學說。腺癌是結(jié)直腸癌最主要的組織學類型，而腺瘤是目前被公 認為結(jié)直腸腺癌最重要的癌前病變。結(jié)直腸癌早期不易發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)患者在出現(xiàn)便血、腹 痛等癥狀三個月到半年后才到醫(yī)院就診。屆時癌細胞已擴散甚至向遠處轉(zhuǎn)移，失去了最佳 的手術(shù)治療時機。此外，若發(fā)生腸阻塞或腸穿孔，患者的5年生存率會進一步降低；同時組 織學分化差（除外MSI-H樣腫瘤），淋巴管/血管侵犯，神經(jīng)侵犯，或切緣接近、不確定或陽 性在NCCN指南中均被認為是預后不良的因素。盡管診療技術(shù)不斷發(fā)展，患者術(shù)后5年生存 率并無明顯改善，缺乏有效的診斷方法實現(xiàn)對結(jié)直腸腺癌及其癌前病變的早期診斷是主要 的原因之一，若能早期發(fā)現(xiàn)并切除結(jié)直腸腺癌及其腺瘤病變，將有助于降低其發(fā)病率及死 亡率。
[0005]目前，早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腸癌的主要途徑以糞便隱血試驗（FOBT)作為結(jié)直腸癌主 要的普查手段，篩選出高危人群進行腸鏡檢查。然而FOBT缺乏特異性，初篩順應性及高危 人群的腸鏡受檢率僅30% -40%，疾病檢出率約19%左右，有待進一步提高。我國人口眾 多，結(jié)直腸癌發(fā)病率上升極為明顯，進一步篩選出腸鏡需檢的人群更為必要。利用無創(chuàng)的腫 瘤標志物對高危人群進行腸鏡篩查，可縮小腸鏡檢查人數(shù)且進一步提高腸鏡的特異性及靈 敏度。目前臨床上推薦用于診斷與預后判斷的重要腫瘤標志物有CEA，但其特異性以及在結(jié) 直腸癌診斷方面的應用備受質(zhì)疑。因此，目前的結(jié)直腸癌腫瘤標志物遠遠不能滿足臨床需 求，尋找理想的用于早期診斷結(jié)直腸癌腫瘤標志物具有重要的臨床意義。
[0006] miRNA是一種分布廣泛的具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，長約18~25個核苷 酸，其通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并能使靶mRNA降解或者阻遏靶mRNA的翻譯， 從而在轉(zhuǎn)錄后對靶標基因的表達水平進行調(diào)節(jié)，參與細胞分化、生長、凋亡、代謝等功能。 miRNA表達具有組織特異性和時序性，在細胞生長和發(fā)育過程中起多種調(diào)節(jié)作用，參與各種 調(diào)節(jié)途徑，與許多疾病有關(guān)尤其是惡性腫瘤。血漿中存在著大量miRNA，不同腫瘤中miRNA 的表達譜也不同，提示血漿miRNA可作為新的腫瘤標志物，用于腫瘤的診斷甚至治療。作為 潛在的生物標志物，miRNA具有蛋白標志物無法比擬的優(yōu)勢，有研究顯示miRNA的在血液中 以核酸-蛋白復合物形式存在或包被于外排顆粒當中，使miRNA耐受包括核糖核酸酶、反 復凍融、PH變化、長期保存等情況，不易被降解，在血液中穩(wěn)定性非常好。近年來，腫瘤相關(guān) miRNA陸續(xù)在腫瘤患者的血液中被發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的無創(chuàng)性早期診斷提供了一條新的途徑。例 如，人血清中 Let-7、miR-9、miR_15a、mi26a、miR-155、miR-34、miR-220 等的高表達分別與 胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病等疾病密切相關(guān)。然而，單一 miRNA作為標志物的敏感 性和特異性仍難以滿足臨床需求，將差異miRNA組合建立腫瘤特異性表達譜將改進單一分 子標志物難以克服的低靈敏度、低特異性問題，成為早期診斷的有效手段。若能獲得特異性 結(jié)直腸癌血漿miRNA組合表達譜，可為其早期診斷提供一條新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種結(jié)直腸癌早期診斷標志物。
[0008] 本發(fā)明所述的結(jié)直腸癌早期診斷標志物是由7種核酸分子組成，所述的核酸分 子包含編碼血漿 miR-1183、miR-938、miR-490-3p、miR-490-5p、miR-592、miR-193b 和 miR-1290的核酸分子；所述的核酸分子在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差 異表達。
[0009] 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)直腸癌早期診斷標志物的進一步特征，編碼血漿 miR-1183、miR-938、miR-490-3p、miR-490-5p、miR-592、miR-193b 和 miR-1290 的核酸分 子在至少一種靶血漿中的表達與在至少一種對照血漿中的表達相比被上調(diào)；以及編碼血漿 miR-490_5p和miR-592的核酸分子在至少一種革El血衆(zhòng)中的表達與在至少一種對照血衆(zhòng)中 的表達相比被下調(diào)。
[0010] 本發(fā)明同時提供一種包括上述結(jié)直腸癌早期診斷標志物的結(jié)直腸癌早期診斷試 劑盒。
[0011] 本發(fā)明的第二個方面是提供另一種結(jié)直腸癌早期診斷標志物。
[0012] 本發(fā)明所述的結(jié)直腸癌早期診斷標志物是由5種核酸分子組成，所述的核酸分 子包含編碼血漿 miR-1183、miR-938、miR-490-3p、miR-490-5p、miR-592、miR-193b 和 miR-1290的核酸分子；所述的核酸分子在至少一種靶血漿中的表達與在至少一種對照血 漿中的表達相比被上調(diào)。
[0013] 本發(fā)明同時提供一種包括上述結(jié)直腸癌早期診斷標志物的結(jié)直腸癌早期診斷試 劑盒。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明所述的結(jié)直腸癌早期診斷試劑盒的進一步特征，所述試劑盒還包括一 個回歸模型，建立 Iogit(P)判別公式如下：logit(P) =-8. 653+49. 783X(miR-1183)+16. 666 X (miR-938)+235. 243 X (miR-490-3p)+0· 690 X (miR-193b)+18. 096 X (miR-1290)，其 中，111丨1?-1183、111丨1?-938、111丨1?-1290、111丨1?-490-3口以及111丨1?-19313的表達水平是以1]6為內(nèi)參檢 測得到，模型中的logit (P)值在至少一種靶血漿中的表達與在至少一種對照血漿中的表 達相比被上調(diào)。
[0015] U6是一類核小分子RNA，已有文獻證實它在人血漿中存在并且表達比較恒定，本 發(fā)明將它做為內(nèi)參基因，以檢測miRNA的相對表達量（Λ CT = CTt_ ^irna-CT內(nèi)參）。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明所述的診斷試劑盒的進一步特征，所述早期結(jié)直腸癌是結(jié)直腸高級別 上皮內(nèi)瘤變。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明所述的診斷試劑盒的進一步特征，所述早期結(jié)直腸癌是?M I期的結(jié) 直腸癌。
[0018] 本發(fā)明的第三個方面是提供一種用于區(qū)分至少一個結(jié)直腸癌患者的血漿和至少 一個健康個體的血漿的試劑盒。
[0019] 本發(fā)明所述的一種用于區(qū)分至少一個結(jié)直腸癌患者的血漿和至少一個健康個體 的血漿的試劑盒，包括上述的結(jié)直腸癌早期診斷標志物，其中，至少一種對照血漿來自健康 個體。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進一步特征，所述試劑盒還包括一個回歸模型，建 立 Iogit(P)判別公式如下：logit (P) = -8. 653+49. 783 X (miR-1183)+16. 666 X (miR-938 )+235. 243X (miR-490-3p)+0. 690X (miR-193b)+18. 096X (miR-1290)，其中，miR-1183、 miR-938、miR-1290、miR-490-3p以及miR-193b的表達水平是以U6為內(nèi)參檢測得到，模型中 的Iogit(P)值在至少一種革El血衆(zhòng)中的表達與在至少一種對照血衆(zhòng)中的表達相比被上調(diào)。
[0021] 本發(fā)明將在結(jié)直腸癌組織內(nèi)異常表達明顯且較恒定的miRNA確