一種ffpe樣本的fish預(yù)處理方法以及預(yù)處理液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種肝癌組織石蠟切片(FFPE)樣本的FISH預(yù)處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自發(fā)熒光是熒光素標(biāo)記等相關(guān)研究中常見(jiàn)的干擾因素，通常由內(nèi)源的核黃素(Flavin)、NAD⑵H的減少、脂褐素(Lipofuscin)、網(wǎng)狀纖維、膠原蛋白和彈性蛋白引起。肝臟、腎臟等代謝旺盛的組織細(xì)胞中，存在大量的NADP-NADPH轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，同時(shí)累積了很多核黃素和脂褐素；在其豐富的血管中，膠原蛋白和彈性蛋白含量也較高，而肝臟中網(wǎng)狀纖維居多。這類(lèi)分子在熒光顯微鏡下具有較強(qiáng)的自發(fā)熒光和背景，嚴(yán)重影響肝組織熒光原位雜交(FISH)的結(jié)果。因此，在熒光原位雜交中，需要對(duì)肝組織石蠟切片樣本進(jìn)行特殊的預(yù)處理，以降低組織自發(fā)熒光和背景。
[0003]現(xiàn)有的石蠟切片樣本常用預(yù)處理方法，可參考CN201410514904中所述，肺癌組織石蠟切片預(yù)處理程序:
[0004]I)將載玻片浸入2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中5分鐘。隨后在丙酮及蒸餾水中漂洗，自然干燥載玻片。
[0005]2)從福爾馬林固定石蠟包埋的肺癌組織中獲取多塊4微米切片，分別置于以上經(jīng)氨基丙基三乙氧基硅烷處理過(guò)的載玻片上。
[0006]3)將組織片置于65 °C下過(guò)夜烘烤；
[0007]4)將組織切片浸入二甲苯中室溫脫蠟2次。每次10分鐘。隨后浸入100%乙醇中5分鐘。
[0008]5)將組織切片依次室溫下置于100%乙醇，85%乙醇，70%乙醇中各2分鐘復(fù)水。將組織切片室溫浸入去離子水3分鐘，用無(wú)絨紙巾試干。
[0009]6) 500C下用30 % (w/v)酸性亞硫酸鈉處理組織切片20_30分鐘。
[0010]7)室溫下于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。
[0011 ] 8)取0.4ml蛋白酶K儲(chǔ)存液(20mg/ml)溶于40ml2XSSC得到蛋白酶K工作液(200 μ g/ml)。將組織切片浸入蛋白酶K工作液中37°C孵育20-30分鐘。
[0012]9)組織切片經(jīng)蛋白酶K處理后，于2XSSC中漂洗2次，每次5分鐘。
[0013]10)將組織切片浸入0.1M HCL中室溫浸泡5_10分鐘。于2XSS溶液中漂洗2次，每次5分鐘。
[0014]11)將組織切片玻片依次浸入_20°C預(yù)冷的70%，85%，100%乙醇中各2分鐘脫水。
[0015]12)將組織切片室溫浸入丙酮溶液2分鐘。
[0016]13)自然干燥玻片。
[0017]14)加熱玻片至56°C。
[0018]然而，常用的這種預(yù)處理方法，一是本身其處理后的FFPE熒光和背景仍然較為嚴(yán)重；二是其主要針對(duì)肺癌，而如前所述，肝癌的干擾因素更多，因此，該方法對(duì)肝癌FFPE的效果較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明的目的在于提供一種FFPE樣本的FISH預(yù)處理方法以及預(yù)處理液，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題。
[0020]本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
[0021]一種用于FFPE樣本的FISH預(yù)處理液，其特征在于，包括:
[0022]預(yù)處理液1:50-100mM EDTA 溶液；pH 6.8-7.2、5_10mM 檸檬酸緩沖液；pH5.8-6.2、I?5wt%硫氰酸鈉溶液中的至少一種；
[0023]預(yù)處理液I1:濃度0.01-0.5界七％滂胺天藍(lán)、濃度0.025_lwt%臺(tái)盼藍(lán)中的至少一種；
[0024]預(yù)處理液II1:濃度0.1_5被％硼氫化鈉；
[0025]以上百分比均為質(zhì)量體積比。
[0026]本發(fā)明的又一技術(shù)方案為:
[0027]一種FFPE樣本的FISH預(yù)處理方法，包括如下步驟:
[0028](I)烤片:將玻片放在50-60°C烤片機(jī)上烤片15-30min ；
[0029](2)脫蠟:在通風(fēng)櫥中，將玻片依次浸入3缸二甲苯中，每次8-15min ；
[0030](3)去除殘留的二甲苯:將玻片依次浸入3缸無(wú)水乙醇中，每次晃動(dòng)幾下，將二甲苯去除干凈；
[0031](4)水化:將玻片依次浸入無(wú)水乙醇、85%乙醇、70%乙醇、去離子水，每次0.5_2min ；
[0032](5)預(yù)處理液I處理:將玻片組織面朝上浸入煮沸的預(yù)處理液I中，平穩(wěn)煮15-25min ；
[0033](6)將玻片浸入去離子水中，洗滌0.5-2min ；
[0034](7)將玻片浸入PBS溶液，洗滌0.5-2min ;
[0035](8)預(yù)處理液II處理:將玻片浸入預(yù)處理液II中，處理8-15min ；
[0036](9)將玻片浸入PBS溶液，洗滌4-6min ;
[0037](10)將玻片浸入現(xiàn)配的預(yù)處理液III中，處理40_60min ；
[0038](11)將玻片浸入去離子水中，洗滌0.5-2min，1-3次；
[0039](12)將玻片浸入pH 7.0的2 X SSC溶液中，洗滌0.5_2min ；
[0040](13)配成終濃度為0.01-0.lmg/mL的蛋白酶K工作液；
[0041](14)將玻片浸入蛋白酶K工作液中，35-40°C消化2_15min，檢測(cè)消化程度；
[0042](15)消化后，將玻片浸入pH 7.0的2 X SSC溶液中，洗滌0.5_2min ;
[0043](16)逐步脫水:將玻片依次浸入70%乙醇、85%乙醇、無(wú)水乙醇，每次2_4min。
[0044]在本發(fā)明中，以上步驟不可打亂，否則難以達(dá)到降低背景的目的。
[0045]其中，步驟(13)方法優(yōu)選為取100 μ L蛋白酶K溶液(20mg/mL)加入到40mL已預(yù)熱至37°C的2 X SSC溶液中。
[0046]其中，步驟(14)每個(gè)考普林瓶放置的玻片優(yōu)選不超過(guò)8片。
[0047]其中，步驟(14)消化程度通過(guò)如下方法進(jìn)行檢測(cè):
[0048]讓玻片自然干燥，滴加1yL DAPI復(fù)染液，蓋上蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察消化情況；若消化過(guò)度，則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)，并縮短消化時(shí)間；若消化不充分，則將玻片浸入2 X SSC溶液中以脫去蓋玻片，然后繼續(xù)消化；若消化適中，則將玻片浸入2 X SSC溶液中以脫去蓋玻片，繼續(xù)以下操作。
[0049]其中，步驟(5)所述預(yù)處理液I包括50-100mM EDTA溶液，pH 7.0、5_10mM檸檬酸緩沖液，pH 6.0、1?5%硫氰酸鈉溶液中的至少一種。
[0050]其中，步驟⑶所述的預(yù)處理液II包括濃度0.01-0.5 %滂胺天藍(lán)、濃度
0.025-1%臺(tái)盼藍(lán)中的至少一種。
[0051]其中，步驟(10)所述的預(yù)處理液III為濃度0.1-5%硼氫化鈉。
[0052]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:
[0053]本發(fā)明采用預(yù)處理液1、I1、III的綜合處理體系，再結(jié)合特定的操作步驟和參數(shù)，可以有效降低FFPE熒光和背景。
[0054]本發(fā)明的處理方法對(duì)干擾多、難處理的肝癌FFPE尤其有效。
【附圖說(shuō)明】
[0055]圖1為實(shí)施例1結(jié)果對(duì)比圖，左:常規(guī)處理；右:本發(fā)明I (H)TA溶液)-1I (滂胺天藍(lán))-1II (硼氫化鈉)處理；
[0056]圖2為實(shí)施例2結(jié)果對(duì)比圖，左:常規(guī)處理；右:本發(fā)明I (檸檬酸緩沖液)-1I (臺(tái)盼藍(lán))-111(硼氫化鈉)處理；
[0057]圖3為實(shí)施例3結(jié)果對(duì)比圖，左:常規(guī)處理；右:本發(fā)明I (硫氰酸鈉溶液)-1I (臺(tái)盼藍(lán))-111(硼氫化鈉)處理。
【具體實(shí)施方式】
[0058]預(yù)處理液1:可以是EDTA溶液(50-100mM，pH 6.8?7.2)、也可以是檸檬酸緩沖液(5-10mM，pH5.8?6.2)、還可以是硫氰酸鈉溶液(濃度為為I ~5% )，處理時(shí)間15_25min ；
[0059]預(yù)處理液I1:滂胺天藍(lán)(濃度0.01-0.5%)，還可以是臺(tái)盼藍(lán)(濃度0.025-1 % )，處理時(shí)間8_15min ；
[0060]預(yù)處理液II1:可以是硼氫化鈉(濃度0.1-5%),處理時(shí)間40-60min。
[0061]以上百分比均為質(zhì)量體積比。
[0062]以下實(shí)施例選取肝癌FFPE組織樣本作為測(cè)試樣本。對(duì)比例參照【背景技術(shù)】中的處
理程序。
[0063]實(shí)施例1
[0064](I)烤片:將玻片放在56°C烤片機(jī)上烤片15min。
[0065](2)脫蠟:在通風(fēng)櫥中，將玻片依次浸入3缸二甲苯中，每次1min。
[0066](3)去除殘留的二甲苯:將玻片依次浸入3缸無(wú)水乙醇中，每次晃動(dòng)幾下，將二甲苯去除干凈。
[0067](4)水化:將玻片依次浸入無(wú)水乙醇、85%乙醇、70%乙醇、去離子水，每次lmin。
[0068](5)預(yù)處理液I (60mM，pH 7.0EDTA溶液)處理:將玻片(組織面朝上)浸入煮沸的預(yù)處理液I中，平穩(wěn)煮20min。
[0069](6)將玻片浸入去離子水中，洗滌lmin。
[0070](7)將玻片浸入PBS溶液，洗滌lmin。
[0071](8)預(yù)處理液II (0.05%滂胺天藍(lán))處理:將玻片浸入預(yù)處理液II中，處理lOmin。預(yù)處理液II使用前應(yīng)振蕩混勻。
[0072](9)將玻片浸入PBS溶液，洗滌5min。
[0073](10)將玻片浸入現(xiàn)配的預(yù)處理液III (5%硼氫化鈉)中，處理50min。
[0074](11)將玻片浸入去離子水中，洗滌lmin，兩次。
[0075](12)將玻片浸入2 X SSC溶液(pH 7.0)中，洗滌Imin0
[0076](13)取出 10yL Proteinase K Solut1n 加入到 40mL 已預(yù)熱至 37°C 的 2 X SSC溶液中(比例為1:400)，配成終濃度為0.05mg/mL的蛋白酶K工作液。
[0077](14)將玻片浸入蛋白酶K工作液中(每個(gè)考普林瓶不宜放置超過(guò)8片)，37°C消化2?15min(消化程度可通過(guò)如下方法進(jìn)行檢測(cè))。
[0078]注:蛋白酶K消化程度對(duì)后續(xù)的雜交有重要影響。因此，為確保樣本消化充分，可按如下方法檢測(cè)樣本消化程度:讓玻片自然干燥，滴加10 μ L DAPI復(fù)染液，蓋上蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察消化情況。若消化過(guò)度，則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)，并縮短消化時(shí)間；若消化不充分，則將玻片浸入2 X SSC溶液中以脫去蓋玻片，然后繼續(xù)消化；若消化適中，則