用于檢測呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲及羊梨形蟲檢測膜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及羊梨形蟲的檢測試紙，及一 種快速檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及羊梨形蟲的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊泰勒蟲病是由羊泰勒蟲（Theileriahirci)引起綿羊和山羊的一種蜱傳性血 液原蟲病，寄生于牛、羊和其它動(dòng)物上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)。1914年最先發(fā)現(xiàn)于 埃及，隨后在非洲、歐洲、亞洲的許多國家都發(fā)現(xiàn)該病原。我國羊泰勒蟲病系楊輔國等在 1957年首先發(fā)現(xiàn)于四川省甘孜藏族自治州乾寧縣。在我國，經(jīng)研究證實(shí)羊的泰勒蟲病病 原并不是以上任何一種，而是新種，初步定名為呂氏泰勒蟲（T. Iuwenshuni)和尤氏泰勒蟲 (T. uilenbergi)，這兩種蟲體的傳播媒介均為青海血蜱。為我國的特有病原。
[0003] 一般而言，泰勒蟲的診斷主要包括三種方法：（1)通過血涂片的方法和臨床 癥狀，例如：Akinboade 0A, DipeoluOO. Comparison of blood smear and indirect fluorescent antibody techniques in detection ofhaemoparasite infections in trade cattle in Nigeria[J] · Vet Parasitol. 1984，14(2) :95-104 ;Darghouth ME, Bouattour A，Ben Miled L，Sassi L. Diagnosis of Theileriaannulata infection of cattle in Tunisia:comparison ofserology and blood smears[J]. Vet Res. 1996 ； 27(6) :613-21。（2)應(yīng)用一些血清學(xué)方法，這種方法是補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT)和間接熒光 抗體試驗(yàn)（IFAT)檢測，但這些方法很難排除不同種之間的交叉反應(yīng)，而且常會(huì)出現(xiàn)假 陽性和漏檢。參見 Bruning A. Equine piroplasmosis an update on diagnosis [J]. Br Vet J， 1996,152:139 ~151，或者 Papadopoulos B，Brossard M，Perie NM(1996) Piroplasms of domestic animals in the Macedonia region ofGreece. 3. Piroplasms of small ruminants. Vet Parasitol 63:67-74。（3) PCR 技術(shù)，是目前檢測泰勒蟲最常 用的分子診斷方法，與常規(guī)的方法相比具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢出率高等優(yōu)點(diǎn)，參見 AlhassanA，Pumidonming Wj Okamura M，Hirita H，Battsetseg B，F(xiàn)ujisald Fj Yokoyama N，Igarashi I (2005)Development of a single-round and multiplex PCR method for the simultaneous detection ofBabesiacabalIi and Babesiaequi in horse blood. Vet Parasitoll29:43-49 ；Altay KjDumanli NjHolman PJjAktas M(2005)Detection of Theileriaovis infected sheep by nested PCR. Vet Parasitol 127:99_104j_SPCR方法 通常不能同時(shí)檢測出混合感染的發(fā)生。我國的病原呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲，具有極強(qiáng)的 致病性和致死性。而且，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病原分布廣泛，直接威脅著我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。所以， 制定有效的檢測預(yù)報(bào)系統(tǒng)對(duì)該病的防治十分迫切和必要。
[0004] 中國發(fā)明專利申請(qǐng)200810018313. 4公開了一種檢測羊泰勒蟲病的ELISA診斷試 劑盒及其制備方法，該方法，包括：可與待測樣品結(jié)合的固體支持物；包被于可與待測樣品 結(jié)合的固體支持物上的羊泰勒蟲裂殖子抗原，每孔〇. Iug ;作為二抗的用酶標(biāo)記的兔抗羊 IgG ;標(biāo)準(zhǔn)羊泰勒蟲陽性血清；標(biāo)準(zhǔn)羊泰勒蟲陰性血清；明膠；底物稀釋液；30% H2O2;無色 底物；終止液；磷酸鹽緩沖液。經(jīng)包被抗原、洗滌、封閉、洗滌、風(fēng)干后密封4°C保存等工藝制 備而成。本發(fā)明具有蟲體抗原特有的高特異性；該ELISA診斷試劑盒實(shí)現(xiàn)了本病檢測的標(biāo) 準(zhǔn)化、自動(dòng)化、且適合羊泰勒蟲病的早期診斷和大規(guī)模的野外血清流行病學(xué)調(diào)查。能早期診 斷本病，一般在感染后5天就能檢出特異性抗體，檢測出血清抗體的最早時(shí)間比比傳統(tǒng)顯 微鏡檢測出的時(shí)間提前5-10天。但該專利申請(qǐng)的方法卻無法區(qū)分患病羊感
[0005] 染的究竟是何種泰勒蟲，這會(huì)影響患病羊只的治療及預(yù)防工作。另一方面該專利 的檢測方法用時(shí)較長，影響到這一方法的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA的檢測膜， 以及該檢測膜的制備方法和使用方法。
[0007] 本發(fā)明用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜是在BiodyneC 薄膜上固定有呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸。
[0008] 本發(fā)明的用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜，在 BiodyneC薄膜上還固定有巴貝斯蟲特異性寡核苷酸和泰勒蟲通用特異性寡核苷酸。
[0009] 本發(fā)明用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、羊梨形蟲的DNA檢測膜，在BiodyneC 薄膜上固定的呂氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為atcttctttttgatgagttg，固定的尤氏泰勒 蟲特異性寡核苷酸序列為tgcattttccgagtgttact，固定的羊梨形蟲特異性寡核苷酸序列為 ctgtcagaggtgaaattct，固定的巴貝斯蟲特異性寡核苷酸序列為ccttggtaatggttaataggaa， 固定的羊巴貝斯蟲未定種特異性寡核苷酸序列為cgggtttcgtctacttcgc，固定的莫氏巴貝 斯蟲特異性寡核苷酸序列為gaatgatgccgacttaaaccct。
[0010] 本發(fā)明用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜的制備方法是 分別人工合成出呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸，將所得到的各寡核苷酸5' 端用氨基團(tuán)修飾，再將其分別共價(jià)結(jié)合到帶有負(fù)電荷的BiodyneC薄膜上；或者是分別人工 合成出巴貝斯蟲特異性寡核苷酸、泰勒蟲通用特異性寡核苷酸呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的 特異性寡核苷酸，將所得到的各寡核苷酸5'端用氨基團(tuán)修飾，再將其分別共價(jià)結(jié)合到帶有 負(fù)電荷的BiodyneC薄膜上。
[0011] 本發(fā)明的檢測膜檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及羊梨形蟲的方法是以待檢測羊血 提取的DNA模板，在泰勒蟲和巴貝斯蟲18S rRNA基因序列V4高變區(qū)兩端的保守區(qū)域設(shè)計(jì) 一對(duì)擴(kuò)增出的片段大小為480bp-491bp的引物，其中一條引物用生物素標(biāo)記，再進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，獲得生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和固定在BiodyneC膜上的泰勒蟲 和巴貝斯蟲的寡核苷酸進(jìn)行雜交，再經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光孵育后將雜交后的膜放置曝光儲(chǔ)片夾 內(nèi)，在薄膜上放X光膠片進(jìn)行曝光，再對(duì)膠片進(jìn)行顯影和定影處理，根據(jù)膠片上產(chǎn)生的強(qiáng)度 信號(hào)確定被檢羊是否有患有相應(yīng)的疾病。
[0012] 本發(fā)明具有如下效果：
[0013] 采用本發(fā)明的檢測膜可以很方便地檢測并區(qū)分出呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲，同時(shí) 由于本發(fā)明的檢測膜上還固定有羊梨形蟲的特異性寡核苷酸，因此本發(fā)明可以同時(shí)檢測多 個(gè)蟲種的存在，同時(shí)可以檢測被檢動(dòng)物感染有一種還是多種梨形蟲，這對(duì)于羊群疾病的控 制及預(yù)防治療有積極的意義。
[0014] 本發(fā)明的方法最大優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測出泰勒蟲和巴貝斯蟲時(shí)，而且只需要作一 次PCR，如果有擴(kuò)增產(chǎn)物，說明動(dòng)物肯定是感染了巴貝斯蟲或泰勒蟲的某一種或幾個(gè)種。另 外，PCR產(chǎn)物與探針雜交后，還能說明被檢動(dòng)物所感染的蟲體的種類，這對(duì)于疾病的控制及 預(yù)防有更為積極的意義。本發(fā)明的敏感性要高于PCR，且能同時(shí)區(qū)分病原的屬和種，這一特 性在流行病學(xué)調(diào)查上具有重要意義。由于與探針雜交的PCR產(chǎn)物可以除去，因此雜交膜可 以反復(fù)使用，據(jù)報(bào)道這種膜至少可以使用20次以上，另外，在一張膜上，可以固化45個(gè)探 針，同時(shí)檢測45個(gè)PCR產(chǎn)物，其成本相對(duì)低廉。
[0015] 采用本發(fā)明的檢測膜進(jìn)行檢測的方法非常的簡單，而且檢測用時(shí)較少，其檢測成 本相對(duì)也比較低，而且漏檢率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于現(xiàn)有技術(shù)。
【附圖說明】
[0016] 圖1為部分患病羊的標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品檢測結(jié)果圖
【具體實(shí)施方式】
[0017] - .含有泰勒蟲和巴貝斯蟲特異寡核苷酸的檢測膜制備：
[0018] 根據(jù)已