一種探針室溫下檢測(cè)耐藥基因多態(tài)性的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] ：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體說(shuō)是涉及一種用分子信標(biāo)二聯(lián)體探 針檢測(cè)多藥耐藥基因 ABCG2 C421A的單核苷酸多態(tài)性。
【背景技術(shù)】 [0002] ：傳統(tǒng)分子信標(biāo)長(zhǎng)約25-35個(gè)堿基，具有類(lèi)似發(fā)夾形狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，被稱(chēng) 為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)分為外環(huán)結(jié)構(gòu)和莖桿結(jié)構(gòu)兩部分，外環(huán)結(jié)構(gòu)是與目的片段互補(bǔ)的核 苷酸單鏈，其功能是識(shí)別目的片段，并與之雜交。莖桿結(jié)構(gòu)為長(zhǎng)度約5-8個(gè)堿基的雙螺旋結(jié) 構(gòu)，其功能是形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不直接參與目的片段的識(shí)別與雜交。在莖的5'端和3'端分別 連有熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)分子信標(biāo)以莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形態(tài)存在時(shí)，位于兩端的熒光分 子與和淬滅分子非常接近（小于IOnm)，此時(shí)給予熒光基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)，會(huì)有熒光共振能量 轉(zhuǎn)移現(xiàn)象發(fā)生，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，因此檢測(cè)不到熒 光信號(hào)。當(dāng)有靶序列存在時(shí)，分子信標(biāo)的序列與靶序列特異性結(jié)合，形成的雙螺旋體比分子 信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，焚光分子與淬滅分子分開(kāi)，焚光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象終止，此時(shí)焚光 分子發(fā)出的熒光可以被檢測(cè)到，且所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與雜交體系中靶序列濃度成正比。 因此，分子信標(biāo)無(wú)需洗脫操作，可以連續(xù)輸出信號(hào)，具有實(shí)時(shí)分辨力。
[0003] 傳統(tǒng)分子信標(biāo)常用于基因表達(dá)的實(shí)時(shí)監(jiān)控，也可用于SNPs檢測(cè)，這種無(wú)需第二次 開(kāi)蓋加樣的"一站式"方法優(yōu)勢(shì)在于對(duì)于操作的簡(jiǎn)化達(dá)到了極致，但同時(shí)也存在不足。首先， 傳統(tǒng)分子信標(biāo)的應(yīng)用范圍在高溫區(qū)，需要精密的溫控設(shè)備輔助，并繪制熔解曲線。為了獲得 與目的單鏈的的互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位置，需要提高外環(huán)序列的Tm值，目前的做法是延長(zhǎng)外環(huán) 序列的長(zhǎng)度，或修飾更多的非天然核酸。前者導(dǎo)致了對(duì)單堿基錯(cuò)配識(shí)別能力的降低，后者則 使成本大幅攀升。其次，傳統(tǒng)分子信標(biāo)至少要制備一對(duì)才能檢測(cè)一種雙等位基因。因此市 場(chǎng)急需開(kāi)發(fā)一種室溫下高特異性，不依賴(lài)溫控設(shè)備，單體即可檢測(cè)一種雙等位基因的探針。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 發(fā)明目的：本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種帶有新型分子信標(biāo)二聯(lián)體探針的試劑盒，實(shí)現(xiàn)了探 針單體在室溫條件下快速檢測(cè)基因 ABCG2 C421A的單核苷酸多態(tài)性，解決了傳統(tǒng)探針在室 溫條件下特異性差，單體不能檢測(cè)雙等位基因的問(wèn)題。
[0005] 技術(shù)方案：
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種探針室溫下檢測(cè)耐藥基因多態(tài)性的試劑盒，包括一種分子信標(biāo)二聯(lián)體探針， 以及室溫雜交預(yù)混液，其特征在于：所述的分子信標(biāo)二聯(lián)體具有雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是由寡核苷酸 單鏈基于堿基互補(bǔ)原則形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分為莖環(huán)結(jié)構(gòu)I和莖環(huán)結(jié)構(gòu)II，這兩個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu) 均由外環(huán)和莖桿兩部分組成；構(gòu)成雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一級(jí)核苷酸序列為5' gcaggtgTTGAATGTCA AGAGTCGcacctgcictgcgagTTGAATTTCAAGAGTCGctcgcag 3'，其中大寫(xiě)堿基組成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 外環(huán)部分，小寫(xiě)無(wú)下劃線堿基組成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖桿部分，5'端修飾綠色熒光基團(tuán)6FAM，3'端 修飾紅色熒光基團(tuán)HEX，中間位置用i表示的T堿基，該試劑盒用于檢測(cè)耐藥基因 ABCG2的 C421A單核苷酸多態(tài)性，檢測(cè)樣本為PCR產(chǎn)物。
[0008] 所述外環(huán)部分的核苷酸用來(lái)識(shí)別目的序列，莖桿部分的核苷酸用于形成二級(jí)結(jié) 構(gòu)，其不直接參與目的序列識(shí)別。
[0009] 這兩個(gè)功能獨(dú)立的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)I用于檢測(cè)ABCG2 C421A的C亞型等位基 因，莖環(huán)結(jié)構(gòu)Π 用于檢測(cè)ABCG2 C421A的A亞型。
[0010] 所述探針的PCR的正向引物序列5 ' TTGTGATGGGCACTCTGACG3 '，反向引物序列 5' CGTCATAGT TGTTGCAAGCCG3'。
[0011] 構(gòu)成雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)一級(jí)核苷酸序列中間位置的i不屬于莖環(huán)結(jié)構(gòu)，僅用于修飾熒光 淬滅基團(tuán)BHQl。
[0012] 室溫雜交預(yù)混液：每10 μ L雜交預(yù)混液中由5 μ L濃度為25mmol/L的MgCl2、4 μ L 甲酰胺和1 μ L濃度為1 μ mol/L的分子信標(biāo)二聯(lián)體組成。
[0013] 所述的分子信標(biāo)二聯(lián)體的制備是通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)的：
[0014] (1)向8聯(lián)管中加入室溫預(yù)混液10 μ L ;
[0015] (2)對(duì)目的基因進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增；
[0016] (3)吸取10 μ L不對(duì)稱(chēng)PCR產(chǎn)物至裝有室溫預(yù)混液的8聯(lián)管中；混勻后利用QPCR 儀等能夠檢測(cè)熒光強(qiáng)度的儀器檢測(cè)熒光強(qiáng)度值。
[0017] 優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0018] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一個(gè)分子信標(biāo)二聯(lián)體單體可以同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)等位基因，無(wú)需加入第 二個(gè)探針，并且在室溫條件下顯示了對(duì)單堿基錯(cuò)配序列顯示了極高的識(shí)別能力。只修飾一 種淬滅基團(tuán)，減少了合成成本。如將分子信標(biāo)二聯(lián)體單體用于微陣列固體表面的修飾，可以 節(jié)省一半的偶聯(lián)位置大幅減少偶聯(lián)所用的時(shí)間及成本。
【附圖說(shuō)明】：
[0019] 圖1 :分子信標(biāo)二聯(lián)體二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；
[0020] 圖2 :分子信標(biāo)二聯(lián)體分別與模板G和模板A雜交的恪解曲線；
[0021] 圖3 :從NCBI Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的基因 ABCG2 C421A附近的序列（含C421A位 點(diǎn)）；
[0022] 圖4 :由NCBI-BLAST得到的PCR產(chǎn)物匹配結(jié)果；
[0023] 圖5 :分子信標(biāo)二聯(lián)體與不同濃度模板雜交的焚光強(qiáng)度-模板濃度線性圖；
[0024] 圖6 :實(shí)例2中部分PCR產(chǎn)物的基因測(cè)序圖（由生工生物工程（上海）股份有限 公司提供）。
【具體實(shí)施方式】：
[0025] -種室溫下檢測(cè)多藥耐藥基因 ABCG2 C421A的單核苷酸多態(tài)性的試劑盒，包括一 種新型的分子信標(biāo)二聯(lián)體探針，以及室溫雜交預(yù)混液，其特征在于：分子信標(biāo)二聯(lián)體具有獨(dú) 特的雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是由寡核苷酸單鏈基于堿基互補(bǔ)原則形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分為莖環(huán)結(jié)構(gòu)I 和莖環(huán)結(jié)構(gòu)II，見(jiàn)圖1所示。
[0026] 分子信標(biāo)二聯(lián)體由兩個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)均由外環(huán)和莖桿兩部分組成，外環(huán)部分的核苷酸 用來(lái)識(shí)別目的序列，莖桿部分的核苷酸用于形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不直接參與目的序列識(shí)別。
[0027] 構(gòu)成雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一級(jí)核苷酸序列為5'gcaggtgTTGAATGTCAAGAGTCGcacctgc主ctg cgagTTGAATTTCAAGAGTCGctcgcag 3'，其中大寫(xiě)堿基組成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的外環(huán)部分，小寫(xiě)無(wú)下劃 線堿基組成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖桿部分，5'端修飾綠色熒光基團(tuán)6FAM和3'端修飾紅色熒光基團(tuán) HEX，中間位置用i表示的T堿基不屬于莖環(huán)結(jié)構(gòu)，僅用于修飾熒光淬滅基團(tuán)BHQl。
[0028] 雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)是兩個(gè)功能獨(dú)立的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)I用于檢測(cè)基因 ABCG2C421A的 C亞型，莖環(huán)結(jié)構(gòu)II用于檢測(cè)A亞型。每個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)在與互補(bǔ)的序列或單堿基錯(cuò)配序列雜 交時(shí)產(chǎn)生的熔解曲線都具有顯著差異，見(jiàn)圖2A、B。選取熒光強(qiáng)度值差異最大的溫度作為觀 測(cè)點(diǎn)見(jiàn)圖2C，并利用甲酰胺將觀測(cè)點(diǎn)調(diào)整至25,見(jiàn)圖2D。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的熔解曲線為降溫曲線， 曲線走向?yàn)閺母邷叵虻蜏兀◤挠蚁蜃螅?。圖2中，A :分子信標(biāo)二聯(lián)體與模板G的熔解曲線 (莖環(huán)結(jié)構(gòu)I的熔解曲線為紅色，莖環(huán)結(jié)構(gòu)II的熔解曲線為藍(lán)色，下同）；B :分子信標(biāo)二聯(lián) 體與模板A的熔解曲線；C :圖A與圖B的合圖，雙箭頭位置的熒光強(qiáng)度差異最大；D :甲酰胺 的加入使熒光強(qiáng)度差異最大位置被降低至25°C附近。
[0029] 利用具有熒光掃描及讀取功能的儀器，在25°C下直接讀取熒光強(qiáng)度值，凡高于臨 界值的樣本為基因型檢出陽(yáng)性，低于或等于臨界值的樣本為基因型檢出陰性。
[0030] 陽(yáng)性樣本臨界值的定義：人工合成兩種基因型模板，用A亞型模板代替實(shí)際樣本 做為C亞型的陰性對(duì)照，繪制熔解曲線，見(jiàn)圖2中的③號(hào)線；用C亞型模板代替實(shí)際樣本做 為A亞型的陰性對(duì)照，繪制熔解曲線，見(jiàn)圖2中的②號(hào)線。包括陰性對(duì)照在內(nèi)的每例待測(cè)樣 本做3個(gè)副孔，以陰性對(duì)照樣本熒光強(qiáng)度的"均值+2X標(biāo)準(zhǔn)差"作為臨界值，與被測(cè)樣本熒 光強(qiáng)度的均值比較，凡熒光強(qiáng)度值高于臨界值的被測(cè)樣本視為該基因型檢出陽(yáng)性，熒光強(qiáng) 度值低于或等于臨界值的被測(cè)樣本視為該基因型檢出陰性。
[0031] 進(jìn)一步的，人工合成的兩種基因型模板序列為：TTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAA AACTTA「C/AlAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACG。該序列與 PCR產(chǎn)物序列相同。括 號(hào)內(nèi)的堿基為突變位點(diǎn)的二等位基因。
[00