用于檢測(cè)經(jīng)典型和變異型豬偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光pcr-hrm引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一組用于檢測(cè)經(jīng)典型和變異型豬偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR-HRM引物，屬于動(dòng)物傳染病學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]偽狂犬病(Pseudorabies virus，PR)是由偽狂犬病毒(PRV)引起的豬和多種家畜及野生動(dòng)物共患的一種流行廣泛，以發(fā)熱、奇癢(除豬外)及腦脊髓炎為特征的急性傳染病。豬是感染后可以存活的唯一物種。感染后臨床癥狀因日齡不同而表現(xiàn)不一，仔豬出現(xiàn)腦脊髓炎和敗血癥，兩周內(nèi)發(fā)病率可達(dá)100% ;妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等繁殖障礙；生長(zhǎng)育肥豬發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道癥狀。近年來(lái)偽狂犬基因缺失苗成功開(kāi)發(fā)及廣泛使用，結(jié)合血清學(xué)的鑒別檢測(cè)，該病總體得到控制。
[0003]但2011年以來(lái)，許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場(chǎng)出現(xiàn)了 PRV流行，主要表現(xiàn)為豬群gE抗體陽(yáng)性率顯著升高，發(fā)病母豬群流產(chǎn)、仔豬神經(jīng)癥狀和死亡率高等典型偽狂犬病癥狀。隨后，該病征在我國(guó)多地規(guī)?；i場(chǎng)相繼爆發(fā)和流行。利用微量中和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)分析表明，這種新發(fā)PRV和經(jīng)典的Bartha k61疫苗產(chǎn)生的抗體在抗原性方面存在一定的差異，簡(jiǎn)稱(chēng)變異型PRV。
[0004]目前，在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛使用的是gE基因缺失基因工程疫苗，通過(guò)對(duì)分離鑒定的變異型和經(jīng)典型PRV毒株的gE基因全長(zhǎng)進(jìn)行序列測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，變異型PRV和經(jīng)典型PRV在1488-1490位CGA (即492位存在有天冬氨酸)插入。
[0005]高分辨率熔解曲線(High Resolut1n Melt, HRM )是一種簡(jiǎn)單、快速、低成本的PCR擴(kuò)增后檢測(cè)技術(shù)，可用于高通量的突變掃描和基因分型。該技術(shù)僅僅只是在標(biāo)準(zhǔn)PCR試劑的基礎(chǔ)上再加入雙鏈DNA結(jié)合染料即可進(jìn)行，無(wú)需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解曲線，即可完成對(duì)樣品基因型的分析。當(dāng)使用SYBR Green I為熒光染料時(shí)，在實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)束后通常要運(yùn)行一步熔解曲線反應(yīng)程序。即將PCR產(chǎn)物的溫度由低到高逐步升高，在升溫的過(guò)程中，雙鏈DNA解鏈成單鏈DNA分子，原先與雙鏈結(jié)合的熒光染料分子就與DNA脫離，而不再產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，隨著溫度的升高，樣品的熒光信號(hào)由強(qiáng)轉(zhuǎn)弱，從而形成一個(gè)熒光信號(hào)隨溫度升高而減弱的熔解曲線圖，再以熒光值隨溫度的變化率為縱坐標(biāo)作圖，就形成熒光變化率隨溫度變化的峰形圖，每一個(gè)樣品在該圖上呈現(xiàn)為一個(gè)峰形曲線。這個(gè)峰值所對(duì)應(yīng)的特定溫度我們就稱(chēng)之為該樣品的熔解溫度Tm，在該溫度下50%的雙鏈已解鏈變?yōu)閱捂湣?br>[0006]本發(fā)明根據(jù)變異型PRV和經(jīng)典型PRV在1488-1490位CGA插入而導(dǎo)致實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增后形成的Tm值差異，來(lái)對(duì)變異型PRV和經(jīng)典型PRV感染情況進(jìn)行鑒別診斷。本發(fā)明對(duì)兩種不同類(lèi)型PRV進(jìn)行一組引物即可特異性鑒別診斷，本發(fā)明的建立可填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一組用于檢測(cè)經(jīng)典型和變異型PRV的PCR-HRM引物，該引物能有效區(qū)分經(jīng)典型和變異型PRV。
[0008]本發(fā)明根據(jù)經(jīng)典型和變異型PRV的gE基因特征，設(shè)計(jì)一組引物，該引物可同時(shí)對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV的gE基因片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，均可獲得特異性目的片段，但用常規(guī)PCR無(wú)法對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV進(jìn)行鑒別診斷。但是由于經(jīng)典型和變異型PRV的gE基因片段V在1488-1490位CGA插入而導(dǎo)致GC含量差異，通過(guò)建立基于SYBR I實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV后的Tm值存在不同，根據(jù)熔解曲線峰值的差異可直接對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV進(jìn)行區(qū)別。
[0009]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一組用于經(jīng)典型和變異型PRV的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示:
上游引物 Pl:5’ - CACGCACGAGGACTACTACGA -3’
下游引物 P2:5’ - TCCTCGGGGTCCAGGCTCGCGTA -3’。
[0010]本發(fā)明PCR-HRM方法，具體包含以下步驟:
(I )、從疑似臨床樣品中提取基因組DNA ；
(2)、以提取的DNA為模板，用權(quán)力要求I所述的引物Pl和P2進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；
(3)、利用高分辨率熔解曲線(HRM)方法導(dǎo)致的經(jīng)典型和變異型PRV熔解溫度(Tm)值差異，對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV進(jìn)行鑒別診斷。
[0011]所述的PCR-HRM引物在制備鑒別診斷經(jīng)典型和變異型豬偽狂犬病毒試劑盒上的應(yīng)用。
[0012]其中，本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)需滿(mǎn)足如下要求:
(I)該實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物需選擇經(jīng)典型和變異型PRV的gE基因中的保守區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便該組引物(Pl和P2)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR均能對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)生成的熔解曲線獲得不同的特異性峰值，通過(guò)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR—起相連接的電腦主機(jī)程序中的Tm值差異，來(lái)對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV感染情況進(jìn)行判定。
[0013]其中，所述的步驟的峰值如下:
若在Tm=93.6 °C出現(xiàn)單一的特異性峰判為變異型PRV陽(yáng)性；若在Tm=92.9 °C出現(xiàn)單一的特異性峰判為經(jīng)典型PRV陽(yáng)性。
[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所提供的引物特異性強(qiáng)，靈敏度高，鑒定方法簡(jiǎn)單，效率和準(zhǔn)確率較高。使用本研究提供的一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)本臨床送檢9份疑似豬偽狂犬病毒感染情況進(jìn)行可視化鑒別診斷的方法，其中新型豬偽狂犬病毒7株，經(jīng)典型豬偽狂犬病毒2株。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV進(jìn)行檢測(cè)的熔解曲線。I為經(jīng)典型PRV陽(yáng)性，2為變異型PRV陽(yáng)性，3為經(jīng)典型和變異型PRV陰性。
[0016]圖2經(jīng)典型和變異型PRV的gE基因差異區(qū)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0018]實(shí)施例1
毒株:
經(jīng)典型和變異型PRV均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定和保存。
[0019]2、引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)經(jīng)典型和變異型PRV的gE基因特征設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Pl和P2，其中引物Pl和P2序列為:
上游引物 Pl:5’ - CACGCACGAGGACTACTACGA -3’
下游引物 P2:5’ - TCCTCGGGGTCCAGGCTCGCGTA -3’。
[0020]該引物擴(kuò)過(guò)經(jīng)典型和變異型PRV的gE基因差異區(qū)，經(jīng)典型和變異型PRV的gE基因差異區(qū)見(jiàn)圖2。
[0021 ] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增
以常規(guī)方法提取經(jīng)典型和變異型PRV的基因組DNA。用所設(shè)計(jì)的特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Pl和P2進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。
[0022]優(yōu)化出的20 μ L最佳反應(yīng)體系為體系:SYBR Premix Ex TaqTM 10 yL、上、下游引物(5 ymol/L)各0.4 yL、模板2 μ L、水補(bǔ)足至20 yL。最佳反應(yīng)條件為:95 °C，2min預(yù)變性；95 V 10 s，62 V 15 s，共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，做出熔解曲線。
[0023]4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線
實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)做出的熔解曲線，根據(jù)經(jīng)典型和變異型PRV在gE基因出存在不同特征，對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV感染情況進(jìn)行判斷，判斷方法為:
從生成的熔解曲線可見(jiàn)看出，若在Tm= (93.6 ±0.1) °C出現(xiàn)單一的特異性峰判為變異型PRV陽(yáng)性；若在Tm= (92.9±0.1) °C出現(xiàn)單一的特異性峰判為經(jīng)典型PRV陽(yáng)性。
[0024]臨床應(yīng)用
應(yīng)用本方法對(duì)臨床送檢9份疑似豬偽狂犬病毒感染情況進(jìn)行可視化鑒別診斷的方法，其中新型豬偽狂犬病毒7株，經(jīng)典型豬偽狂犬病毒2株。本發(fā)明的這組引物還可用來(lái)對(duì)豬群感染經(jīng)典型和變異型PRV的類(lèi)型和程度進(jìn)行定量分析。
[0025]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于檢測(cè)經(jīng)典型和變異型豬偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR-HRM引物，其特征在于:所述引物組其核苷酸序列如下所示: 上游引物 Pl:5’ - CACGCACGAGGACTACTACGA -3’ 下游引物 P2:5’ - TCCTCGGGGTCCAGGCTCGCGTA -3’。2.如權(quán)利要求所述的引物用于檢測(cè)經(jīng)典型和變異型豬偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR-HRM方法，其特征在于，包含以下步驟: (I )、從疑似臨床樣品中提取基因組DNA ； (2)、以提取的DNA為模板，用權(quán)力要求I所述的引物Pl和P2進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增； (3)、利用高分辨率熔解曲線方法導(dǎo)致的經(jīng)典型和變異型豬偽狂犬病毒熔解溫度(Tm)值差異，對(duì)經(jīng)典型和變異型PRV進(jìn)行鑒別診斷。3.如權(quán)利要求1所述的PCR-HRM引物在制備鑒別診斷經(jīng)典型和變異型豬偽狂犬病毒試劑盒上的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一組用于檢測(cè)經(jīng)典型豬偽狂犬病毒（Pseudorabies？virus,PRV）和變異型豬偽狂犬病毒的引物，屬于動(dòng)物傳染學(xué)領(lǐng)域。該引物根據(jù)經(jīng)典型PRV和變異型PRV在gE基因上的差異設(shè)計(jì)，由于變異型PRV和經(jīng)典型PRV在492位氨基酸處各插入一個(gè)天冬氨酸，經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)不同的熔解溫度（Tm）峰值差異，即建立區(qū)分變異型PRV和經(jīng)典型PRV感染情況的高分辨率熔解曲線（HRM）方法。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物僅需一組引物即可對(duì)變異型PRV和經(jīng)典型PRV進(jìn)行鑒別診斷，同時(shí)還可特異性的明確豬只感染經(jīng)典型和變異型PRV的感染程度。本發(fā)明使用方法簡(jiǎn)單有效，成本低廉，準(zhǔn)確性高。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/70, C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105018645
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510451308
【發(fā)明人】陳如敬, 吳學(xué)敏, 周倫江, 陳秋勇, 車(chē)勇良, 嚴(yán)山, 王晨燕, 王隆柏, 魏宏, 劉玉濤
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月29日