一種檢測牛流行熱病毒的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)（Lateral Flow Assay)檢測牛流行熱病毒所用的引物和探針組合及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛流行熱是由牛流行熱病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)引起的牛的 急性、熱性傳染病。該病來勢猛、傳播快、發(fā)病率高，常于開始發(fā)病后10天內(nèi)引起大區(qū)域流 行。發(fā)病奶牛產(chǎn)乳量和奶質(zhì)下降，種公牛精液質(zhì)量受損，部分懷孕母牛流產(chǎn)，有的病牛癱瘓 甚至死亡，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，該病在我國頻繁發(fā)生，部分地區(qū)的陽性 率高達(dá)81 %，嚴(yán)重制約了養(yǎng)牛業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，在農(nóng)業(yè)部2014年印發(fā)的《牛羊常見疫病 防控技術(shù)指導(dǎo)意見》文件中將其列為牛重點(diǎn)防控的疫病。
[0003] 目前檢測BEFV的主要方法有病毒分離、免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、血清 中和試驗(yàn)、電鏡檢查等，但這些方法不僅操作繁瑣復(fù)雜、耗時耗力，而且難以用于BEFV的現(xiàn) 場診斷。因此，亟需建立一套快速、準(zhǔn)確、簡便的診斷方法，為該病的現(xiàn)場診斷提供新一代的 檢測技術(shù)與手段。
[0004] 重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是不同于 PCR的核酸檢測技術(shù)，主要有結(jié)合單鏈核酸重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶 三種酶參與。其原理是利用重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋 找同源序列。在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，使模板DNA解鏈，引物與模板DNA開始配對形 成復(fù)制所需的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸，形成新的DNA互補(bǔ)鏈，對 模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。引物序列的設(shè)計與選擇對RPA的結(jié)果至關(guān)重要。在 RPA擴(kuò)增體系中加入一個生物素標(biāo)記的反向引物和5'熒光標(biāo)記的探針，探針標(biāo)記的熒光基 團(tuán)30個堿基處有一個脫堿基位點(diǎn)（dSpacer)，該位點(diǎn)是DNA修復(fù)酶作用的底物，可被核酶 nfo識別切割，產(chǎn)生新的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸，從而使雙標(biāo)信 號與擴(kuò)增產(chǎn)物的累積同步，檢測結(jié)果可在抗FAM金標(biāo)結(jié)合和抗生物素捕獲抗體的側(cè)流層析 試紙條上顯示。
[0005] 目前對于RPA技術(shù)的研究尚處于起步階段，將RPA技術(shù)應(yīng)用于BEFV檢測還未見報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明首次采用RPA結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)建立快速檢測BEFV的方法，并通過特異性 和靈敏度評價，可用于臨床現(xiàn)場檢測，為BEFV的現(xiàn)場檢測提供一種靈敏、可靠的新方法。
[0007] 針對RPA側(cè)流層析技術(shù)應(yīng)用于BEFV臨床現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明提供了 一種準(zhǔn)確、快速、簡便檢測BEFV的RPA檢測方法。僅需通過對臨床樣品進(jìn)行病毒RNA的提 取，以及一步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行等溫擴(kuò)增，不需要熱循環(huán)反應(yīng)，不必在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò) 增，結(jié)果可在側(cè)流層析試紙條上清晰顯示，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)程序簡單、檢測時 間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于牛場快速、準(zhǔn)確、簡便的進(jìn)行BEFV的診治。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0009] -種用于通過RPA技術(shù)檢測BEFV的引物和探針組合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探針序列如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 正向引物：5' -AGGATGGAGAATGGTGGAGTATAGAAAACC-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0011] 反向引物：5'-【Biotin】CTCGTGGGAGCCAAGTAAGACATATCTAATGT-3'；（SEQ ID No. 2)
[0012] 探針序列：5' -【FAM】 AGGATGCACACAGATAGAACAGAGTTTGAA【dSpacer】 AATTAGATATTAAGGC【C3-spacer】-3'（探針5' -端用FAM標(biāo)記，距離5' -端30個堿基左右 的位置處用dSpacer替代一個堿基，3'端用C3-spacer阻斷）。（SEQ ID No. 3)
[0013] 需要說明的是：與常規(guī)PCR反應(yīng)不同，RPA反應(yīng)所需引物的長度通常為30-35bp， 探針序列的長度為46-52bp，引物設(shè)計時為了避免形成引物內(nèi)部及之間的二級結(jié)構(gòu)，其長度 的增加也使引物設(shè)計及選擇難度的增加，因此，引物的設(shè)計和選擇對RPA的結(jié)果至關(guān)重要。 RPA技術(shù)正處于起步研究階段，尚無專門的引物、探針設(shè)計軟件，也沒有大量的數(shù)據(jù)為其引 物設(shè)計原則提供依據(jù)。因此，本發(fā)明的引物和探針組合是需要從靶標(biāo)序列兩端設(shè)計多對引 物進(jìn)行優(yōu)化、篩選才能得到。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種檢測BEFV的試劑盒，該試劑盒中包含有用于通過RPA技術(shù)檢 測BEFV的引物和探針組合。
[0015] 進(jìn)一步的，該檢測試劑盒中還包括有：BEFV陽性對照模板、RPA擴(kuò)增試劑、去離子 水和側(cè)流層析檢測試劑。BEFV陽性對照模板、RPA擴(kuò)增試劑、去離子水與引物和探針組合一 起構(gòu)成RPA擴(kuò)增體系。
[0016] 所述RPA擴(kuò)增試劑包括Rehydration緩沖液、大腸桿菌來源的recA重組酶、鏈置 換DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB)、280mM醋酸鎂（MgAc)溶液。
[0017] 所述RPA側(cè)流層析檢測試劑包括側(cè)流層析試紙條，雜交檢測緩沖液 (1XPBS+0. 1% Tween20)。
[0018] 所述BEFV陽性對照模板的制備方法為：分別在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的引物對的上游和下游設(shè)計引物：
[0019] 上游引物：5' -ATGTTCAAGGTCCTCATAATTACCTTG-3'（SEQ ID No. 4);
[0020] 下游引物：5' -TTAATGATCAAAGAACCTATCATCAC-3'（SEQ ID No. 5);
[0021] 以BEFV基因組cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50yL :10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5 μ L、2. 5mM dNTP Mixture 8 μ L、LA Taq 0· 5 μ L (5U/ μ L)、模板 2 μ L， 10 ymol/L的上下游引物各2 yL，滅菌超純水加至50 yL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min， 然后進(jìn)入94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，共進(jìn)行31個循環(huán)；72°C延伸10min，最后停止于 4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片斷后克隆至pEAST-T3載體（該載體為常 規(guī)的載體，商業(yè)化購買到），藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，送華大基因進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行比 對，正確的重組質(zhì)粒為BEFV陽性對照模板。
[0022] 具體的，一種檢測BEFV的試劑盒，每50yL RPA擴(kuò)增體系中含有正向引物、反向引 物各 2. 1 μ L (10 μ mol/L)，探針 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，BEFV 陽性對照模板 2 μ L，Rehydration 緩沖液29. 5 μ L，去離子水11. 2 μ L和醋酸鎂溶液（280mM) 2. 5 μ L。
[0023] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用RPA技術(shù)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)檢測BEFV的方法，步驟如 下：
[0024] (1)應(yīng)用快速提取病毒RNA試劑盒提取樣品中或樣品病毒培養(yǎng)上清液的RNA，按照 Fermentas RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)，獲 得BEFV的cDNA模板；
[0025] (2)根據(jù)BEFV保守區(qū)域設(shè)計RPA特異性引物和探針，向RPA擴(kuò)增試劑盒推 薦反應(yīng)的50 yL擴(kuò)增體系中加入正向引物、反向引物各2. IyL (10 μ mol/L)，探針 0· 6 yL(10 μ mol/L)，模板 DNA 2 yL，29. 5 yLRehydration 緩沖液，11. 2 yL 去離子水和 2. 5 μ L醋酸鎂溶液（280mM)，于含有凍干酶粉的0. 2mL TwistAmp nf〇反應(yīng)管中，恒溫水浴 鍋內(nèi)38 °C反應(yīng)25分鐘；
[0026] (3)應(yīng)用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測，若側(cè)流層析試紙條上顯現(xiàn)出檢測帶 和對照帶，則檢測結(jié)果為陽性，若試紙條僅顯示對照帶，則結(jié)果為陰性。
[0027] 上述檢測方法不僅可用于BEFV的現(xiàn)場檢測，還包括非疾病的BEFV檢測，包括環(huán)境 氣溶膠樣本中BEFV的檢測。
[0028] 應(yīng)用上述方法可以篩選出一套可快速有效檢測出BEFV成分的引物及探針組合。
[0029] 將已知病毒滴度為1.0 X 105TCID5Q/mL的BEFV用DEPC水進(jìn)行10倍系列稀釋后， 提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示可以檢測到ITCID 5。的靶標(biāo)分子，證明該方法 具有較高的靈敏度。
[0030] 以Loxio2TCHD5qBEFV樣品的cDNA作為模板，利用上述的引物和探針進(jìn)行RPA 等溫擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在側(cè)流層析試紙條上顯現(xiàn)出檢測帶和對照帶，而以其它病毒的DNA或 cDNA為模板擴(kuò)增均僅顯示對照帶，表明該方法具有較好的特異性。
[0031] 以合成的ItcidmBEFV樣品的cDNA作為模板